廖建紅，趙　梅，徐德祥，陳遠(yuǎn)華，于曉玲，蘇　暢，章新瓊，胡　燕，宇　寰

細(xì)菌脂多糖對(duì)妊娠期小鼠血脂代謝的影響

廖建紅1，趙梅1，徐德祥2，陳遠(yuǎn)華3，于曉玲1，蘇暢1，章新瓊1，胡燕1，宇寰1

目的 探討細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）對(duì)妊娠期小鼠血脂代謝的影響。方法 ICR雌鼠分為非孕鼠組、妊娠第5天即孕早期（GD5）組、孕中期（GD8）組、孕晚期（GD15）組，每組再分為對(duì)照組和LPS組，分別給予生理鹽水和低劑量LPS 40 μg/kg腹腔注射。為了進(jìn)一步解釋小鼠孕期接觸不同劑量LPS對(duì)血脂代謝的影響，取非孕鼠組和GD8組小鼠，分別腹腔注射LPS 10、40、160 μg/kg。所有小鼠在腹腔注射后禁食16 h，取血清進(jìn)行血脂檢測(cè)，取肝臟用于實(shí)時(shí)定量PCR（RTPCR）法檢測(cè)脂肪酸攝取、合成、氧化和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因。結(jié)果 ①與對(duì)照非孕鼠組比較，不同孕期小鼠血清三酰甘油（TG）和極低密度脂蛋白（VLDL）濃度隨著受孕周期的增加而逐步增加，并且從孕中期始增加明顯，而血清總膽固醇（TCH）和高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）水平在孕晚期顯著升高；②在LPS處理后，與LPS非孕鼠比較，血清TG和VLDL在孕早期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在孕中期和孕晚期顯著增加，血清TCH和HDL-C則在孕早期既已出現(xiàn)上升趨勢(shì)；③孕中期接觸LPS存在劑量效應(yīng)關(guān)系，LPS 40 μg/kg足以引起孕期血脂代謝紊亂；④RT-PCR結(jié)果顯示，肝臟脂肪酸攝取、從頭合成相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)顯著增加，而脂肪酸氧化相關(guān)基因mRNA水平明顯下降。結(jié)論 妊娠期接觸LPS可引起孕鼠血脂代謝紊亂。

細(xì)菌脂多糖；妊娠；血脂代謝；三酰甘油；極低密度脂蛋白

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.024.html

在妊娠這一特殊生理時(shí)期，會(huì)引起母體脂質(zhì)代謝改變等一系列適應(yīng)性變化，包括血脂和脂蛋白水平的升高。正常情況下，其引起的高血脂狀態(tài)有利于滿足母體能量需要和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育；但高血脂狀態(tài)超出生理性需要時(shí)，可引起脂質(zhì)代謝紊亂。而感染和炎癥引起的急性期反應(yīng)可以導(dǎo)致多種脂質(zhì)和脂蛋白改變［1］。細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁層的主要成份。研究［2-3］表明，妊娠期細(xì)菌性陰道炎、宮內(nèi)感染、牙周病等會(huì)引起孕期暴露LPS。并且人與動(dòng)物腸道內(nèi)存在大量革蘭陰性細(xì)菌產(chǎn)生并釋放細(xì)菌內(nèi)毒素，嚴(yán)重創(chuàng)傷和感染等情況下病灶細(xì)菌會(huì)釋放大量LPS引起內(nèi)毒素血癥。課題組前期研究［4］表明，孕期接觸LPS可引起胚胎死亡、畸胎、流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎兒生長(zhǎng)遲緩等。然而，孕期接觸LPS對(duì)母體脂質(zhì)代謝的影響尚未見報(bào)道。該研究擬比較LPS對(duì)非孕與不同孕期小鼠血脂特點(diǎn)的影響，并進(jìn)一步探討LPS對(duì)孕鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，從而系統(tǒng)研究接觸LPS對(duì)孕鼠血脂代謝的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源 8～10周齡健康ICR小鼠（雄34～36 g、雌28～30 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)室溫度：20～25℃，濕度：（50±5）%。小鼠于晚9點(diǎn)按雌雄比4∶2合籠，次日晨7點(diǎn)查雌鼠陰栓，查到陰栓者定為受孕第0天（GD0），正常飲食、飲水，定期監(jiān)測(cè)兩組小鼠體重。

1.2動(dòng)物分組與處理 將小鼠分為非孕鼠組、孕早期組（GD5）、孕中期組（GD8）、孕晚期組（GD15），各組再進(jìn)一步分為對(duì)照組和LPS組，LPS組分別腹腔注射LPS 40 μg/kg體重，LPS劑量參考文獻(xiàn)［5］。對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。為了進(jìn)一步解釋小鼠孕期接觸不同劑量LPS對(duì)血脂代謝的影響，取非孕鼠組和GD8小鼠，分別腹腔注射LPS 10、40、160 μg/kg體重，比較兩組血脂代謝的改變。每組均6只，所有小鼠腹腔注射后禁食16 h，取血清進(jìn)行血脂檢測(cè)，取肝臟-80℃保存用于實(shí)時(shí)定量-PCR法檢測(cè)。

1.3檢測(cè)方法與試劑 血清脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)采用安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司RL7600D全自動(dòng)生化分析儀）進(jìn)行檢測(cè)，包括血清三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCH）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、極低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein，VLDL）。LPS（大腸桿菌LPS，血清型0127：B8）購自美國(guó)Sigma公司；實(shí)時(shí)定量-PCR試劑盒購自美國(guó)Promega公司；PCR特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1　實(shí)時(shí)定量-PCR擴(kuò)增使用的引物序列

1.4實(shí)時(shí)定量-PCR 每組選取6只小鼠，每只小鼠肝臟組織取50 mg，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。根據(jù)260 nm波長(zhǎng)下樣品總RNA的吸光度（optical density，OD）值計(jì)算樣品中RNA含量，定量至0.5 μg/μl。采用OD260/OD280鑒定RNA的純度，用瓊酯糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)RNA的完整性。取2.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組分前將總RNA在70℃變性10 min，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在42℃孵育60 min后在95℃加熱5 min中止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA保存于-80℃冰箱。取1.0 μl DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在95℃預(yù)變性5 min啟動(dòng)熱啟動(dòng)酶，按95℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸30 s三步法循環(huán)擴(kuò)增50次，末次循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線分析以檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量。以18s核糖體RNA（Rn18s）作為PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的內(nèi)對(duì)照，用LightCycler 480軟件（德國(guó)羅氏公司，版本1.5.0）按2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。各組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1非孕和不同孕期小鼠血脂水平的比較 為觀察不同孕期小鼠血脂特點(diǎn)，與對(duì)照非孕鼠比較，血清TG和血清VLDL濃度隨著受孕周期的增加而逐步增加，并且從孕中期始增加明顯；而TCH與HDL-C則在孕晚期明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2　小鼠不同孕期血脂代謝特點(diǎn)（mmol/L，n=6，±s）

表2　小鼠不同孕期血脂代謝特點(diǎn)（mmol/L，n=6，±s）

與對(duì)照非孕鼠比較：*P＜0.05，**P＜0.01

?

2.2接觸LPS對(duì)非孕和不同孕期小鼠血脂的影響為比較各組孕鼠在LPS處理后不同孕期的血脂特點(diǎn)，與LPS非孕鼠比較，血清TG和VLDL在孕早期，與非孕鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在孕中期和孕晚期，則顯著增加（P＜0.05），血清TCH和HDL-C則在孕早期既已出現(xiàn)上升趨勢(shì)，各項(xiàng)指標(biāo)在孕晚期達(dá)最高峰（P＜0.01）。并且LPS處理組分別與對(duì)照GD5、對(duì)照GD8、對(duì)照GD15比較，也明顯增加其血脂水平，孕中期后愈明顯，見表2、3。

表3　小鼠不同孕期接觸LPS對(duì)血脂代謝的影響（mmol/L，n=6，±s）

表3　小鼠不同孕期接觸LPS對(duì)血脂代謝的影響（mmol/L，n=6，±s）

與LPS非孕鼠比較：*P＜0.05，**P＜0.01

?

2.3小鼠孕期接觸不同劑量LPS對(duì)血脂代謝的影響 上述結(jié)果表明，小鼠血脂水平從孕中期始增加明顯，而且也是從孕中期始孕鼠接觸低劑量LPS（40 μg/kg）后血脂代謝變化明顯。選擇孕中期小鼠和非孕期對(duì)照小鼠，比較不同劑量LPS對(duì)其血脂代謝的影響，顯示LPS 10 μg/kg處理對(duì)非孕鼠及孕鼠血脂的改變有上升的趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在LPS 40、160 μg/kg處理后，分別與相同劑量非孕鼠比較，孕鼠組各項(xiàng)指標(biāo)，隨著劑量的增加，均明顯上升，但非孕鼠則上升不明顯。兩組分別與各自對(duì)照組比較，也具有相同效應(yīng)。見表4。

2.4LPS對(duì)孕鼠肝臟脂肪酸攝取、合成、氧化與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA水平的影響 在GD8腹腔注射LPS 40 μg/kg，與對(duì)照組比較，顯示其肝臟脂肪酸攝取關(guān)鍵酶脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（CD36）mRNA水平明顯上升；肝臟脂肪酸合成關(guān)鍵酶脂肪酸合成酶（fas）、乙酰輔酶A羧化酶（acc）、硬酯酰輔酶A去飽和酶-1（scd1）mRNA水平均明顯升高；而肝臟脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α（cpt1α）和ω-氧化關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450酶4a10（cyp4a10）和cyp4a14 mRNA水平顯著受到抑制；肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵酶微粒體TG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（mttp）和載脂蛋白B（abob）mRNA水平有上升趨勢(shì)，但前者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

3　討論

妊娠狀態(tài)能夠影響母體正常的脂質(zhì)代謝，孕婦體內(nèi)雌、孕激素等胎盤激素水平逐漸升高，至妊娠晚期達(dá)高峰，從而使脂肪組織的降解能力逐漸增強(qiáng)，肝臟合成TG水平升高［6］；肝臟作為體內(nèi)脂質(zhì)生成的主要場(chǎng)所，VLDL負(fù)責(zé)將肝臟內(nèi)源性合成的TG等脂質(zhì)運(yùn)輸至血液等肝外組織，其代謝受到脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的調(diào)節(jié)［7］。在孕中晚期，脂肪組織中脂解活性加強(qiáng)，導(dǎo)致LPL活性降低，使得脂肪組織攝取血液循環(huán)中TG能力下降，肝細(xì)胞分泌VLDL增多，從而使血脂水平升高，主要表現(xiàn)為高TG血癥［8］。本研究中，正常孕鼠血清TG和VLDL隨著孕期的增加而增加，各項(xiàng)血脂水平均高于非孕期，并且所有指標(biāo)在孕晚期都達(dá)到最高值，與上述結(jié)論一致。

表4　小鼠孕期接觸不同劑量LPS對(duì)血脂代謝的影響（mmol/L，n=6，±s）

表4　小鼠孕期接觸不同劑量LPS對(duì)血脂代謝的影響（mmol/L，n=6，±s）

與非孕鼠LPS相同劑量比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與對(duì)照組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

項(xiàng)目TGTCHHDL-CVLDL非孕鼠對(duì)照組1.54±0.301.92±0.281.81±0.230.67±0.13 LPS 10 μg/kg1.58±0.622.21±0.481.97±0.420.61±0.20 LPS 40 μg/kg2.38±0.36#2.41±0.27#1.92±0.260.88±0.14#LPS 160 μg/kg2.46±0.84#2.59±0.44#1.86±0.201.23±0.32##F值11.406.660.1119.72 GD8對(duì)照組2.29±0.51*2.05±0.491.91±0.370.89±0.17*LPS 10 μg/kg2.56±0.45*2.41±0.442.07±0.330.95±0.17*LPS 40 μg/kg3.37±0.81*##3.05±0.61*##2.14±0.181.26±0.32*#LPS 160 μg/kg4.74±1.04**##3.48±0.65*##2.49±0.28*#1.76±0.38**##F值28.4220.5210.6026.47

表5　LPS對(duì)肝臟脂肪酸攝取、合成、氧化與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的比較（n=6，±s）

表5　LPS對(duì)肝臟脂肪酸攝取、合成、氧化與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的比較（n=6，±s）

與對(duì)照GD8比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項(xiàng)目指標(biāo)對(duì)照GD8LPS GD8攝取cd36/18s1.00±0.222.97±0.98**合成fas/18s1.00±0.392.90±0.95**acc/18s1.00±0.141.47±0.47**scd1/18s1.00±0.221.38±0.14**氧化cpt1α/18s1.00±0.370.54±0.25**cyp4a10/18s1.00±0.310.12±0.06**cyp4a14/18s1.00±0.360.06±0.03**轉(zhuǎn)運(yùn)mttp/18s1.00±0.261.22±0.55 apob/18s1.00±0.211.41±0.42*

研究［1］表明，炎癥或感染可引起血脂質(zhì)代謝改變。LPS也被廣泛地用于建立炎癥或感染的動(dòng)物模型。研究［9］顯示，低劑量LPS是通過肝臟脂肪酸從頭合成增加，使得肝臟脂蛋白生成增多；而高劑量LPS則是通過降低LPL活性、延遲富含TG脂蛋白的清除率，導(dǎo)致脂蛋白的分解代謝下降，從而誘導(dǎo)形成高TG血癥。但是肝臟VLDL生成過多和血脂異常作為感染性反應(yīng)的特點(diǎn)，其機(jī)制尚未完全明確［10］。本研究中LPS進(jìn)一步促進(jìn)孕期血清TG、VLDL水平的升高，與非孕鼠比較，血中TG水平孕晚期已達(dá)到5.42 mmol/L；并且在孕中期給予LPS 10、40、160 μg/kg，與非孕鼠相同劑量比較，結(jié)果顯示隨著LPS劑量增加，其血脂代謝紊亂越明顯，但非孕鼠則上升不明顯，說明LPS對(duì)孕期血脂代謝的影響，相較于非孕鼠，具有更明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，這些結(jié)果提示，小鼠妊娠期間對(duì)低劑量LPS影響血脂代謝的敏感性較非孕時(shí)強(qiáng)。

如前所述，LPS升高孕期血清TG、VLDL水平的升高可能通過調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸代謝，本研究進(jìn)一步探討了孕期接觸LPS對(duì)肝臟脂肪酸攝取、從頭合成、氧化和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。CD36作為脂肪酸從血漿向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，是促進(jìn)肝細(xì)胞攝取長(zhǎng)鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶，在肝臟脂質(zhì)代謝中具有重要作用［11］。本研究中，LPS可顯著上調(diào)孕鼠肝臟CD36 mRNA水平，說明孕期接觸LPS可促進(jìn)肝外組織脂肪酸通過血漿向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，使肝細(xì)胞攝取脂肪酸增多。越來越多的研究［12］證實(shí)，肝臟脂肪酸合成增加在肝臟脂質(zhì)沉積和非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中起主要作用。對(duì)非孕鼠的研究［13］結(jié)果顯示，LPS可進(jìn)一步上調(diào)小鼠肝臟fas基因表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，LPS孕鼠組肝臟fas、acc和scd1 mRNA水平也相應(yīng)升高，提示LPS可上調(diào)肝臟脂肪酸合成關(guān)鍵酶fas、acc和scd1的基因表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)合成增加。而另一項(xiàng)研究［14］表明，LPS通過白介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK-1）通路，下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR α），降低腎臟和肝cpt1α mRNA水平，從而抑制游離脂肪酸氧化，從而誘導(dǎo)血液循環(huán)中游離脂肪酸和TG水平上升。本項(xiàng)研究中，LPS處理后，肝臟脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶cpt1α和ω氧化關(guān)鍵酶cyp4a10和cyp4a14 mRNA水平均較非孕鼠顯著降低，說明孕期接觸LPS有可能通過抑制脂肪酸氧化水平，進(jìn)而促進(jìn)高TG血癥的形成。一項(xiàng)禁食大鼠的動(dòng)物研究［15］表明，LPS引發(fā)的高TG血癥是由于肝臟生成VLDL增加以及其外周的代謝降低，且與apob和mttp mRNA水平的上升有關(guān)。mttp是肝細(xì)胞中VLDL和小腸細(xì)胞中乳糜微粒合成和分泌所必需的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白；肝細(xì)胞合成TG后，由mttp轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，再與apob等合成VLDL，從而將肝內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞外。本研究中LPS組mttp與apob mRNA水平有上升趨勢(shì)，但僅后者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明孕期接觸LPS可以通過上調(diào)apob基因表達(dá)水平，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。以上結(jié)果表明，LPS可能通過肝臟攝取脂肪酸增加，促進(jìn)肝臟脂質(zhì)合成增加，并且抑制肝臟脂肪酸氧化水平，使孕期血清脂質(zhì)水平上升。

本研究通過系統(tǒng)地探討LPS對(duì)孕鼠血脂代謝影響，證明LPS加重孕期血脂代謝紊亂，對(duì)深入研究LPS干擾孕期脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制提供依據(jù)，為孕期感染所致母體脂質(zhì)代謝紊亂制定合理有效的防治對(duì)策提供理論依據(jù)，而且妊娠期避免接觸LPS對(duì)于預(yù)防妊娠并發(fā)癥和降低不良妊娠結(jié)局具有深遠(yuǎn)的意義。

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Effects of lipopolysaccharide on serum lipid metabolism of pregnancy mice

Liao Jianhong1，Zhao Mei1，Xu Dexiang2，et al
（1School of Nursing，2Dept of Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effect of lipopolysaccharide（LPS）on lipid metabolism in pregnant mice. Methods ICR female mice were divided into four groups［non pregnant group，pregnancy 5 days（GD5）group，GD8 group，and GD15 group］.Mice in each group were divided into control group and LPS group.Mice were intraperitoneally injected with saline and low dose of LPS（40 μg/kg）respectively.To further explain the effects of different doses of LPS on lipid metabolism in mice during pregnancy，nonpregnant mice group and GD8 group were intraperitoneal injected with LPS 10，40，160 μg/kg respectively.Mice were sacrificed 16 h after LPS.Blood serum was collected for serum lipids measurement and liver was collected for RT-PCR to detect related genes of fatty acid intake，synthesis，oxidation and lipid transport.Results ①Compared with the control nonpregnant mice，serum TG and VLDL concentrations elevated gradually with the gestational age，and increased significantly from the second trimester of pregnancy，while the serum levels of TCH and HDL-C significantly increased in the third trimester of pregnancy；②After LPS treatment，compared with LPS nonpregnant mice，serum TG and VLDL had no significant difference in the first trimester of pregnancy，while increased significantly in the second and third stage of pregnancy.The serum levels of TCH and HDL-C increased in early pregnancy；③There was a dose-response relationship between LPS treatment and the disorder of lipid metabolism in the middle of pregnancy，while LPS 40 μg/ kg was sufficient to cause the disorder of lipid metabolism；④RT-PCR results showed that，liver fatty acid intake and synthesis related genes mRNA levels were significantly increased，and liver fatty acid oxidation related genes mRNA levels decreased significantly.Conclusion LPS exposure during pregnancy causes the disorder of serum lipid metabolism.

lipopolysaccharide；pregnancy；serum lipid metabolism；triglyceride；very low density lipoprotein

R 714.148

A

1000-1492（2016）06-0813-05

2016-01-18接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81100449）；安徽醫(yī)科大學(xué)青年拔尖人才支持計(jì)劃資助；安徽省科技廳第二批科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：1303063025）

安徽醫(yī)科大學(xué)1護(hù)理學(xué)院、2公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系、3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，合肥 230032

廖建紅，女，碩士研究生；趙 梅，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：haizhaomei@163.com