王　芳，劉盛智，賴(lài)　坤，周翔宇

線(xiàn)栓法及結(jié)扎法制作大鼠下肢缺血模型的比較

王芳，劉盛智，賴(lài)?yán)ぃ芟栌?/p>

用線(xiàn)栓和結(jié)扎股動(dòng)脈兩種方法制備SD大鼠下肢缺血模型，通過(guò)多普勒激光掃描記錄各組雙下肢血流灌注值（PU），取大鼠雙后肢腓腸肌及線(xiàn)栓處股動(dòng)脈進(jìn)行HE染色；手術(shù)側(cè)腓腸肌，采用Western blot法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（CD31）。結(jié)果顯示，結(jié)扎組的組織炎癥、水腫發(fā)生時(shí)間較線(xiàn)栓組提前，而組織血流灌注在第49天時(shí)兩組并無(wú)太大差異，結(jié)扎組的VEGF和CD31變化時(shí)間均比線(xiàn)栓組提前，但兩者的變化趨勢(shì)是一樣的，在第49天時(shí)除線(xiàn)栓組CD31外，均可恢復(fù)正常水平。長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察兩種模型并沒(méi)有太大差異，故兩種方法都可制作慢性下肢缺血模型。

結(jié)扎法；線(xiàn)栓法；下肢缺血模型

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.072.html

隨著人們生活水平的日益提高、飲食結(jié)構(gòu)及人口老齡化等因素的改變，外周動(dòng)脈疾?。╬eripheral artery disease，PAD）的發(fā)病率和死亡率逐年增加。對(duì)下肢缺血性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程及其治療手段的探索顯得尤為迫切，而建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是研究下肢缺血性疾病的基礎(chǔ)。目前用得最多的方法是外周動(dòng)脈結(jié)扎法以及血管栓塞法，該研究就線(xiàn)栓法和結(jié)扎法兩種方式制作大鼠下肢缺血模型并對(duì)其缺血效果進(jìn)行比較。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 SD大鼠，雄性，63只，190～240 g，平均225 g，購(gòu)自四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組（21只）、線(xiàn)栓組（21只）、結(jié)扎組（21只）。moorLDI2-HIR激光多普勒血流儀購(gòu)自英國(guó)Moor Instruments公司；手術(shù)顯微鏡及顯微手術(shù)器械購(gòu)自重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 模型制作前準(zhǔn)備：大鼠常規(guī)飲食，提前1 d用1%戊巴比妥鈉（30～50 mg/kg）腹腔麻醉后用寵物剃毛器將大鼠下腹部及雙下肢毛發(fā)剔除，再用10%的硫化鈉祛除殘余毛發(fā)。

1.2.1動(dòng)脈結(jié)扎組（結(jié)扎組）模型的制作 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，術(shù)前行激光多普勒掃描后仰臥固定，左后肢常規(guī)消毒鋪巾，在左側(cè)腹股溝部作縱形切口，分離暴露股動(dòng)脈，范圍從腹股溝韌帶至隱動(dòng)脈、腘動(dòng)脈分叉處。于腹股溝韌帶處雙重結(jié)扎股動(dòng)脈主干，遠(yuǎn)端結(jié)扎隱動(dòng)脈、腘動(dòng)脈等分支，術(shù)畢，縫合切口。

1.2.2動(dòng)脈線(xiàn)栓組（線(xiàn)栓組）模型的制作 麻醉方法、切口位置及股動(dòng)脈分離同上，于腹股溝韌帶處分離股動(dòng)脈主干后放入微型血管夾阻斷血流，用顯微剪在手術(shù)顯微鏡下于股動(dòng)脈前壁開(kāi)一小口，向遠(yuǎn)端插入1 cm長(zhǎng)4-0的鎳鈦記憶合金縫線(xiàn)。用10個(gè)0的手術(shù)縫線(xiàn)縫合股動(dòng)脈切口，松開(kāi)血管夾，見(jiàn)無(wú)活動(dòng)性出血后縫合切口。

1.2.3對(duì)照組 麻醉方法、切口位置及股動(dòng)脈分離同上，分離后的股動(dòng)脈不做任何處理，隨后縫合切口。

1.3觀(guān)察指標(biāo)

1.3.1后肢血流量測(cè)定 術(shù)前、術(shù)后立即、術(shù)后3、7、14、21、28、35、42、49 d對(duì)3組大鼠常規(guī)麻醉后，于相對(duì)恒定的26℃室溫下，行多普勒激光掃描記錄雙側(cè)血流灌注（perfusion unite，PU）值。比較3組SD大鼠手術(shù)側(cè)（左側(cè)）與非手術(shù)側(cè)（右側(cè)）肢體的PU比值。

1.3.2組織學(xué)檢查 HE染色：于術(shù)后7、14、21、28、35、42、49 d行激光多普勒掃描后處死各組大鼠，取大鼠雙后肢腓腸肌及線(xiàn)栓處股動(dòng)脈，采用甲醛固定、石蠟包埋，用作HE染色。

1.3.3提取蛋白 取適當(dāng)組織液氮研磨，按組織∶PMSF∶RIPA=1 mg∶0.1 μl∶10 μl的比例加入EP管中冰上裂解，超聲、離心（4℃、12 000 r/min離心10 min），吸上清液，測(cè)蛋白濃度，加入loading buffer，沸水浴5 min。

1.3.4Western blot法檢測(cè) 樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，敷一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min，暗室曝光、顯影、定影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1組織學(xué)結(jié)果

2.1.1腓腸肌組織HE染色結(jié)果 線(xiàn)栓組：術(shù)后14 d細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常染色均勻，術(shù)后28 d可見(jiàn)細(xì)胞染色不均，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，第49天可見(jiàn)少量纖維結(jié)締組織增生。結(jié)扎組：術(shù)后14 d細(xì)胞腫脹染色不均，原有形態(tài)改變，術(shù)后21 d見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)變圓，術(shù)后28 d可見(jiàn)纖維結(jié)締組織增生，第49天見(jiàn)大量纖維結(jié)締組織增生。各組大鼠右側(cè)側(cè)腓腸肌組織形態(tài)改變不明顯。

2.1.2線(xiàn)栓組血管HE染色 術(shù)后14 d線(xiàn)栓處血管的組織結(jié)構(gòu)保持完好，無(wú)內(nèi)膜增生，未見(jiàn)血栓。術(shù)后21 d見(jiàn)血管內(nèi)膜開(kāi)始增生，術(shù)后28 d血管內(nèi)膜大量增生，幾乎完全堵塞血管。

圖1　腓腸肌和線(xiàn)栓組血管HE染色A：線(xiàn)拴組術(shù)后14 d腓腸肌 ×400；B：線(xiàn)拴組術(shù)后28 d腓腸肌×400；C：線(xiàn)拴組術(shù)后49 d腓腸肌 ×200；D：結(jié)扎組術(shù)后14 d腓腸肌 ×400；E：結(jié)扎組術(shù)后28 d腓腸肌 ×400；F：結(jié)扎組術(shù)后49 d腓腸肌 ×200；G：線(xiàn)栓組術(shù)后14 d線(xiàn)栓處血管 ×100；H：線(xiàn)栓組術(shù)后21 d線(xiàn)栓處血管 ×100；I：線(xiàn)栓組術(shù)后28 d線(xiàn)栓處血管×100

2.2激光多普勒血流成像儀檢測(cè)雙下肢血流灌注

與術(shù)前（圖2A）比較，線(xiàn)栓組術(shù)后患側(cè)血流減少不明顯（圖2B），結(jié)扎組術(shù)后血流明顯減少（圖2C）。對(duì)照組在整個(gè)過(guò)程中血流PU值（左側(cè)/右側(cè)）變化不明顯。結(jié)扎組和線(xiàn)栓組均在術(shù)后達(dá)到最低值（0.509 4±0.046 0 vs 0.678 5±0.072 6），P＜0.001）隨后逐漸升高，術(shù)后7 d內(nèi)血流恢復(fù)較快，術(shù)后3 d和7 d結(jié)扎組血流分別恢復(fù)到原來(lái)的79.6%、94.1%，線(xiàn)栓組血流分別恢復(fù)到原來(lái)的84.8%、87.2%，其中結(jié)扎組血流恢復(fù)速度快于線(xiàn)栓組，術(shù)后7～49 d血流恢復(fù)較緩慢，術(shù)后49 d兩組血流分別為原來(lái)的103.5%、95.8%（圖2D）。

圖2　激光多普勒血流成像儀監(jiān)測(cè)雙下肢血流灌注A：術(shù)前兩側(cè)下肢血流灌注；B：線(xiàn)栓組術(shù)后血流灌注；C：結(jié)扎組術(shù)后血流灌注；D：三個(gè)組各時(shí)間點(diǎn)的PU比值（左/右），其中1～10分別代表術(shù)前、術(shù)后立即、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d、術(shù)后14 d、術(shù)后21 d、術(shù)后28 d、術(shù)后35 d、術(shù)后42 d、術(shù)后49 d；與結(jié)扎組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.3Western blot檢測(cè)結(jié)果 VEGF：結(jié)扎組從第1周開(kāi)始依次減少，第3周含量最低，然后逐漸升高，第6周回到正常水平。線(xiàn)栓組含量從第3周開(kāi)始減少，第5周時(shí)最低，第7周回到正常水平。CD31：結(jié)扎組前3周含量較正常水平低，第4周時(shí)增高，隨后依次降低，7周時(shí)恢復(fù)正常水平。線(xiàn)栓組從第2周到第4周含量依次減少，第5周時(shí)增高，第5周到第7周逐漸降低。見(jiàn)圖3。

3　討論

圖3　Western blot法檢測(cè)結(jié)扎組和線(xiàn)栓組1～7周各時(shí)間點(diǎn)的VEGF和CD31的變化情況A：術(shù)前；B：術(shù)后1周；C：術(shù)后2周；D：術(shù)后3周；E：術(shù)后4周；F：術(shù)后5周；G：術(shù)后6周；H：術(shù)后7周

世界范圍由PAD導(dǎo)致患者截肢率逐年增加［1-2］，尋找切實(shí)可行擬人性好的動(dòng)物研究模型，才能使基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化為臨床所用。自1987年Couffinhal et al通過(guò)結(jié)扎小鼠股動(dòng)脈及各分支成功建立了后肢缺血模型后又將實(shí)驗(yàn)對(duì)象擴(kuò)展到Wistar大鼠、SD大鼠等其他鼠類(lèi)動(dòng)物［3］。隨后在不斷探索中，有人指出這種模型的病理生理和組織恢復(fù)情況與臨床上PAD患者不同，血管的急性阻塞會(huì)立即導(dǎo)致血管的應(yīng)答，會(huì)強(qiáng)有力的刺激側(cè)支生長(zhǎng)［4］，于是研究者們開(kāi)始探索新的造模方法，出現(xiàn)了以縮窄器［4-5］、各種栓塞微粒［3，6］、介入［7-8］、線(xiàn)栓［9］等栓塞法逐步阻斷血流的方式，但目前各種方式仍處于探索之中，并沒(méi)有得到國(guó)際公認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)扎和線(xiàn)栓股動(dòng)脈兩種方法，研究其在大鼠下肢長(zhǎng)期缺血過(guò)程中是否有差異，以制備更好的下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。HE染色顯示，結(jié)扎組腓腸肌組織的細(xì)胞腫脹和炎細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生時(shí)間都比線(xiàn)栓組早而且更嚴(yán)重，在長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察中纖維結(jié)締組織增生也更明顯。同時(shí)血管慢性阻塞過(guò)程使組織有時(shí)間來(lái)適應(yīng)缺血，所以不會(huì)造成嚴(yán)重的組織損傷。激光多普勒動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)皮膚微循環(huán)血流量顯示兩組的PU值均在術(shù)后達(dá)到最低值，1周后并無(wú)太大差異，兩者的變化時(shí)間點(diǎn)差不多一致。VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，是最有效的促血管生長(zhǎng)因子。CD31為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，兩者都可用于評(píng)估血管生成。兩組的VEGF和CD31變化趨勢(shì)是相似的，但結(jié)扎組兩個(gè)指標(biāo)的改變時(shí)間均較線(xiàn)栓組提前，說(shuō)明結(jié)扎組側(cè)支循環(huán)的建立要比線(xiàn)栓組快，有研究［5，7］指出這可能和血管剪應(yīng)力和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)系。試驗(yàn)中除了線(xiàn)栓組的CD31外，其他因子都能在7周的時(shí)間內(nèi)達(dá)到正常水平，證明兩種方法在長(zhǎng)時(shí)間缺血上并無(wú)太大差異。

通過(guò)對(duì)各研究的觀(guān)察顯示，采用不同的栓塞材料［6-7］栓塞股動(dòng)脈，最后導(dǎo)致的組織學(xué)、組織因子、激光多普勒的變化都有一定差異，這也可能是栓塞法沒(méi)有得到國(guó)際認(rèn)可的原因。而結(jié)扎法中結(jié)扎血管的范圍不同最后的缺血效果也不相同［6，10-12］。綜上所述，兩種方法都可以制備下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ停欢螘r(shí)間內(nèi)肢體缺血程度、組織學(xué)和組織因子的改變有一定差異，但在較長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)中，兩組差異并不是很明顯。故兩種方法均可用于制備慢性肢體缺血，但結(jié)扎法的操作性、可控性明顯優(yōu)于線(xiàn)栓法。

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Comparison between ligation and suture-occlusion to establish hind-limb ischiemia model in rats

Wang Fang，Liu Shengzhi，Lai Kun，et al
（Dept of Vascular and Thyroid Surgery，The First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，Luzhou 646000）

Male SD rats were divided into ligation induced hind-limb ischemia group，suture-occlusion induced hind-limb ischemia group，sham operation group respectively.Ligation group was subjected to ligate the femoral artery，the occlusion group was occluded the femoral artery by suture.The laser Doppler imager was performed to evaluate the blood flow at different time points after operation.Then，the rats were sacrificed and the gastrocnemius and vessel were achieved to be further examined after angiography.Western blot was used to detect the protein expression of VEGF and CD31.Typical pathological manifestation of hind-limb ischemia was found in both experimental models，such as inflammation infiltration，edema and muscle fibrosis.There was no obvious difference of the blood flow in the two experimental groups.Western blot results showed that the protein expressions of VEGF and CD31 were decreased at early time of ischima，then gradually restored till on the 49th day，which indicated that similar proteins changes happened in two ischima groups.There was no obvious difference in two ischemia models，so the two methods could be used to induce chronic hind-limb ischemia animal model successfully.

ligation；embolization；hindlimb；ischemia model

R 654.4

A

1000-1492（2016）06-0913-04

2016-03-04接收

四川省衛(wèi)生計(jì)生委2014年科研基金（編號(hào)：140035）

四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管甲狀腺外科，瀘州646000

王 芳，女，碩士研究生；周翔宇，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xiangyuzhou971@163.com