楊　洋，徐　燕，孟明理，汪　晨，王　敬，王曉靜，周永敏，沈繼龍

牙齦卟啉單胞菌對牙周膜成纖維細胞活性、炎性因子與骨代謝基因表達的影響研究

楊洋1，徐燕1，孟明理1，汪晨1，王敬1，王曉靜1，周永敏1，沈繼龍2

目的 探討牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）活菌感染牙周膜成纖維細胞（PDLF）后對細胞活性、炎性因子和骨代謝相關(guān)基因表達的影響。方法 P.gingivalis活菌分別以109、108、107、106、105CFU/ml濃度感染PDLF 6 h，檢測細胞活性和白細胞介素-6（IL-6）、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、RANKL、骨保護素（OPG）的基因表達。結(jié)果P. gingivalis攻擊PDLF 6 h后，細胞活性差異無統(tǒng)計學意義。與對照組比較，P.gingivalis濃度分別達到108CFU/ml和107CFU/ml時，IL-6和IL-8基因表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），P.gingivalis濃度達到109CFU/ml時，IL-1β、TNF-α基因表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。各實驗組OPG基因表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），RANKL基因表達差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 P.gingivalis活菌感染PDLF后，可產(chǎn)生一系列的細胞因子，參與牙周組織的破壞與改建。

牙齦卟啉單胞菌；牙周膜成纖維細胞；細胞因子；破骨細胞

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.012.html

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是慢性牙周炎的主要致病菌，含有一系列的毒力因子。其中脂多糖、菌毛、牙齦素等是P.gingivalis表面最重要的致病因子。脂多糖可刺激巨噬細胞分泌多種細胞因子和炎癥介質(zhì)，牙齦素可通過大量的蛋白水解活動侵襲破壞宿主組織。P.gingivalis可侵入宿主細胞、抵抗宿主先天性免疫系統(tǒng)、分泌大量毒力因子、引發(fā)機體的免疫炎癥反應(yīng)，進而導致牙周組織的破壞［1］。牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLF）是牙周膜中最主要的細胞［2］，對于牙周炎的發(fā)生發(fā)展以及組織修復和改建具有重要作用。炎癥狀態(tài)下，PDLF可表達細胞因子并與破骨前體細胞表面的受體連接進而刺激其向破骨細胞分化［3］。該研究旨在觀察P.gingivalis體外對PDLF的攻擊，探討P.gingivalis對PDLF活性、細胞因子和骨代謝的基因表達的影響，以期為進一步研究P.gingivalis對PDLF的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料和試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；臺盼藍（美國Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；P.gingivalis（ATCC33277，本課題組平行實驗贈予）；紫外可見分光光度計UV-7504（上海欣茂儀器有限公司）；Countstar細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）。

1.2PDLF的分離培養(yǎng)取 12～22歲因正畸減數(shù)拔除的健康前磨牙，運用組織塊法用刀片刮取根中1/3部位的牙周膜，將組織塊置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)［2］。

1.3P.gingivalis活菌體外感染PDLF 取第3～4代PDLF，胰酶消化離散細胞，含10%FBS的DMEM重懸，以2×105/ml密度接種于6孔板（每孔2 ml），培養(yǎng)24 h后待細胞貼壁，換不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞匯合，分為6組（5組實驗組，1組對照組）。將P.gingivalis用PBS重懸，紫外可見分光光度計測量濃度，調(diào)整至109CFU/ml，當光密度（optical density，OD）值OD660=0.8時，細菌濃度為109CFU/ml［4］，1 000 r/min離心5 min后加入等量不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸。將含P.gingivalis的DMEM培養(yǎng)基稀釋制成不同濃度：109、108、107、106、105CFU/ml，分別加入PDLF中培養(yǎng)6 h，對照組PDLF以等量DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時間［5］，觀察細胞形態(tài)。

1.4臺盼藍染色法檢測細胞活性 參考文獻［6］報道，采用臺盼藍染色檢測細胞活性。取第3～4代PDLF，胰酶消化，以1×105/ml接種于24孔板中，待細胞匯合，P.gingivalis活菌感染6 h后，PBS沖洗3次，胰酶消化，加等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。取10 μl細胞懸液與10 μl 0.2%臺盼藍染液混合，細胞計數(shù)儀計數(shù)，計算細胞活率。

1.5實時定量PCR法檢測 分別取P.gingivalis活菌體外感染6 h后的PDLF，加入TRIzol裂解細胞，Ex TaqTMⅡ反應(yīng)體系測定白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、RANKL和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的mRNA表達。95℃預變性10 min，95℃、30 s，58℃、1 min，72℃、1 min，共40個循環(huán)［7］。實驗所用引物見表1，引物由生工生物工程上海有限公司和寶生物工程（大連）有限公司合成，以β-actin為內(nèi)參，其他各基因產(chǎn)物分別與相應(yīng)β-actin產(chǎn)物作比較，所得比值為相關(guān)基因mRNA的相對水平。

表1　炎性因子和骨代謝基因表達的相關(guān)引物序列

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1P.gingivalis活菌感染PDLF后的細胞形態(tài)學觀察 接種P.gingivalis活菌6 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)呈梭形或多角形。當細菌濃度達到109CFU/ml時，肉眼觀察可見培養(yǎng)基渾濁，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞膜不完整，胞核不清晰。見圖1。

圖1　109CFU/ml P.gingivalis感染PDLF 6 h后于倒置相差顯微鏡下觀察 ×200

2.2臺盼藍染色檢測細胞活性 與對照組比較，P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，細胞活率均下降，隨著細菌濃度的升高，細胞活率逐漸下降，109、108、107、106、105CFU/ml及對照組的細胞活率分別為（75.5±2.55）%、（76.2±9.98）%、（78.0± 7.77）%、（78.8±4.95）%、（79.9±4.61）%、（91.9 ±6.27）%，但各組間差異無統(tǒng)計學意義（F= 2.595，P＞0.05）。

2.3實時定量qRT-PCR法檢測P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后的mRNA表達 采用qRT-PCR法檢測P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后IL-6、IL-8、OPG、RANKL、IL-1β、TNF-α的mRNA相對表達情況。qRT-PCR結(jié)果顯示P.gingivalis活菌濃度從105CFU/ml升高至109CFU/ml，促炎細胞因子IL-6（圖2A）、IL-1β（圖2B）、TNF-α（圖2D）和RANKL（圖2E）的mRNA表達呈相對升高趨勢。P.gingivalis濃度達到108CFU/ml時，IL-6的mRNA相對表達量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=30.960，P＜0.01），P.gingivalis濃度達到109CFU/ml時，IL-1β、TNF-α的mRNA相對表達量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=11.021、6.537，P＜0.01）。P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后趨化因子IL-8（圖2C）的mRNA相對表達量相對升高，當P.gingivalis活菌濃度達到107CFU/ml時，差異有統(tǒng)計學意義（F= 128.297，P＜0.01）。此外，P.gingivalis活菌濃度從105CFU/ml升高至109CFU/ml，RANKL的mRNA表達亦呈升高趨勢，于108CFU/ml濃度下相對表達量最高，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F= 5.082，P＞0.05）。P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后所有實驗組OPG（圖2F）的mRNA表達均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（F=39.839，P＜0.01），當P.gingivalis活菌濃度為109CFU/ml時，OPG的mRNA相對表達量最低。

3　討論

近年來關(guān)于P.gingivalis活菌及其各毒力因子感染機體細胞的研究日益增多。作為牙周炎的主要致病菌之一，探討P.gingivalis活菌對牙周組織細胞的作用對于研究牙周炎的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。本實驗結(jié)果顯示P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，細胞活率雖然有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義。與P.gingivalis活菌不同，分別用脂多糖或者高溫滅活后的P.gingivalis感染牙齦上皮細胞，可誘發(fā)程序性細胞死亡，但是含有大量P.gingivalis的牙齦上皮細胞并未發(fā)生程序性細胞死亡或者壞死，其原因在于P.gingivalis活菌可通過內(nèi)源性信號通路抑制牙齦上皮細胞程序性死亡［8］。由此推測，P.gingivalis活菌侵入PDLF中，可抑制細胞程序性死亡，進而逃避宿主免疫防御機制，從而使自身能在宿主細胞內(nèi)長期存留，引發(fā)深層感染。

單純的牙周致病菌存在并不是導致牙周組織破壞的唯一原因［9］，宿主對菌斑生物膜的免疫炎癥反應(yīng)是導致牙周軟硬組織破壞的主要原因［10］。本實驗檢測了P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，促炎細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和趨化因子IL-8的基因表達。當P.gingivalis活菌濃度達到108CFU/ml和107CFU/ml時，IL-6和IL-8的mRNA相對表達量均升高，差異有統(tǒng)計學意義。由于P.gingivalis脂多糖和P.gingivalis產(chǎn)生的硫化氫氣體均可促進牙周膜細胞IL-6、IL-8的mRNA表達，同時二者還能協(xié)同促進牙周膜細胞IL-6、IL-8的mRNA表達［11］，故而推測本實驗中IL-6、IL-8基因表達的升高可能是P.gingivalis活菌表面的毒力因子（如脂多糖）以及其產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物（如硫化氫氣體）共同作用的結(jié)果。當P.gingivalis活菌濃度達到109CFU/ml時，IL-1β、TNF-α的mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義。Kato et al［12］發(fā)現(xiàn)P.gingivalis脂多糖可促進牙周膜干細胞IL-6、IL-8、IL-1β的產(chǎn)生。研究［13］表明利用P.gingivalis超聲提取物作用肝癌細胞系Hepa-1.6 6 h后，細胞的TNF-α的mRNA亦升高。P.gingivalis屬口腔正常菌群，達到一定的數(shù)量可成為致病優(yōu)勢菌。本實驗結(jié)果亦提示炎性因子相對表達量的多少可能與P.gingivalis活菌的濃度有關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示，P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，RANKL的mRNA相對表達量雖有升高但差異無統(tǒng)計學意義，而所有實驗組OPG的mRNA相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義。Scheres et al［5］以108CFU/ml的P.gingivalis活菌攻擊PDLF 6 h后，RANKL的mRNA表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。RANKL/OPG是一對與牙槽骨吸收和改建密切相關(guān)的細胞因子。RANKL是破骨生成的關(guān)鍵因子，可與核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）結(jié)合，促進破骨細胞的分化、活化和成熟。OPG可作為誘騙受體與RANKL結(jié)合競爭性抑制RANKL/RANK信號系統(tǒng)，抑制破骨細胞的分化和活化并促進破骨細胞凋亡，是破骨細胞生成的負相調(diào)節(jié)因子［14］。由此推測P.gingivalis感染6 h內(nèi)，PDLF可通過下調(diào)OPG的基因表達參與骨代謝的調(diào)控。

圖2　P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、RANKL、OPG的mRNA表達A：IL-6 mRNA；B：IL-1β mRNA；C：IL-8 mRNA；D：TNF-α mRNA；E：RANKL mRNA；F：OPG mRNA；與對照組比較：**P＜0.01

綜上所述，PDLF可在P.gingivalis感染后產(chǎn)生一系列不同的細胞因子，參與牙周組織的破壞與改建。PDLF在牙周炎的炎性與骨代謝相關(guān)的細胞因子產(chǎn)生中具有重要的作用。但是PDLF產(chǎn)生這些細胞因子的具體機制，如何調(diào)控其基因表達使其產(chǎn)生更有利于牙周組織修復與改建的細胞因子尚需進一步研究。

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Effects of viable Porphyromonas gingivalis on the viability and gene expression of inflammatory cytokines and bone metabolism of periodontal ligament fibroblasts

Yang Yang，Xu Yan，Meng Mingli，et al
（Stomatologic College of Anhui Medical University，The Affiliated Stomatologic Hospital of Anhui Medical University，Key Lab.of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To study the cell viability and gene expression of inflammatory cytokines and bone metabolism of periodontal ligament fibroblasts（PDLF）upon challenge by viable Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）. Methods Human PDLF was challenged in vitro by viable P.gingivalis for 6 hours and then the cell viability and gene expression of inflammatory cytokines such as IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α，RANKL，OPG were analyzed.Results No obvious change in cell viability was observed before and after challenged by viable P.gingivalis.The expressions of both IL-6 and IL-8 were strongly induced when the concentration of viable P.gingivalis was 108CFU/ ml and 107CFU/ml.The expression of IL-1β and TNF-α also increased significantly when the concentration of viable P.gingivalis was 109CFU/ml.The expression of OPG was suppressed significantly by P.gingivalisin in PDLF while the gene expression of RANKL remained unchanged.Conclusion When challenged by P.gingivalis，PDLF participates in the regeneration and remodeling of periodontal tissue by producing cytokines.

Porphyromonas gingivalis；periodontal ligament fibroblasts；cytokines；osteoclast

R 780.2

A

1000-1492（2016）06-0786-05

2016-04-01接收

安徽省自然科學基金（編號：1408085MKL28）

1安徽醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學人獸共患病安徽省重點實驗室，合肥230032

楊 洋，女，碩士研究生；徐 燕，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：173236344@qq.com