張?jiān)钜担豕饷鳌鳎ù罄泶髮W(xué)臨床醫(yī)學(xué)院：.內(nèi)科；.病理科，云南大理67000）

HCY-2在正常人胚消化系統(tǒng)發(fā)育中的作用

張?jiān)?，李耀康2，王光明2△（大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院：1.內(nèi)科；2.病理科，云南大理671000）

目的研究同型半胱氨酸誘導(dǎo)基因2（HCY-2）在人胚消化系統(tǒng)發(fā)育的主要器官食管、胃、小腸和肝臟中的表達(dá)，探討HCY-2在消化系統(tǒng)發(fā)育中的作用。方法收集不同時(shí)期正常發(fā)育的人胚食管、胃、小腸和肝臟，采用免疫組織化學(xué)卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法和圖像分析技術(shù)對(duì)食管、胃、小腸和肝臟HCY-2的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果HCY-2在人胚食管、胃、小腸和肝臟發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中均表達(dá)，不同妊娠期表達(dá)強(qiáng)弱不等，表達(dá)蛋白主要分布在消化管黏膜上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)，并且分布在細(xì)胞質(zhì)中。HCY-2在食管黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)，妊娠中期最強(qiáng)，妊娠早期最弱；HCY-2在胃黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)，近足月最強(qiáng)，妊娠中期最弱；HCY-2在小腸黏膜上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的表達(dá)隨著胚胎的發(fā)育而逐漸減弱，妊娠早期最強(qiáng)，近足月最弱。結(jié)論HCY-2可能參與了人胚消化管和消化腺的發(fā)育。

高半胱氨酸；基因；消化系統(tǒng)/胚胎學(xué)；免疫組織化學(xué)；同型半胱氨酸誘導(dǎo)基因-2；人胚；消化管；消化腺

同型半胱氨酸誘導(dǎo)基因2（homocysteine induced gene-2，HCY-2）是用同型半胱氨酸刺激體外培養(yǎng)血管平滑肌時(shí)克隆的新基因［1-2］，在成年大鼠肝臟、肺臟、腎臟、心臟、血管、脊髓和腦組織等器官，以及在人胚心臟發(fā)育過(guò)程中廣泛表達(dá)［3-4］，在畸形人體胚胎心臟中的表達(dá)異常［4］。王光明等［5］研究發(fā)現(xiàn)，用同型半胱氨酸刺激培養(yǎng)的心肌細(xì)胞增殖與HCY-2的表達(dá)密切相關(guān)，但HCY-2在人胚消化系統(tǒng)中的表達(dá)及HCY-2表達(dá)異常與消化系統(tǒng)發(fā)育畸形的關(guān)系尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為探討人胚消化系統(tǒng)發(fā)育中HCY-2的表達(dá)狀態(tài)，本研究采用免疫組織化學(xué)方法分析發(fā)育不同時(shí)期正常人胚食管、胃、小腸和肝臟HCY-2的表達(dá)變化，旨在揭示HCY-2表達(dá)蛋白在人胚消化系統(tǒng)發(fā)育中的作用。

1　材料與方法

1.1材料（1）HCY-2抗體購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所。（2）正常人胚（胎齡以受精齡計(jì)算）20例，其中妊娠早期（4～8周）人胚6例，妊娠中期（3～4個(gè)月）人胚5例，妊娠晚期（5～6個(gè)月）人胚5例，近足月（8個(gè)月以上）人胚4例。以上人胚均來(lái)源于北京大學(xué)附屬第三醫(yī)院和北京市和平里醫(yī)院，所有胚胎均因某種原因流產(chǎn)后已死亡。

1.2方法

1.2.1人胚食管、胃、小腸和肝臟的獲得取正常發(fā)育不同時(shí)期的人胚食管、胃、小腸和肝臟，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后，以5 μm厚度組織切片。

1.2.2免疫組織化學(xué)卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法為顯示正常發(fā)育不同時(shí)期人胚食管、胃、小腸和肝臟HCY-2的表達(dá)，按照免疫組織化學(xué)ABC法步驟進(jìn)行染色，其中抗HCY-2抗體為1∶800（體積比），陰性對(duì)照組用0.1 mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液代替一抗。

1.2.3圖像分析用Q-500圖像分析系統(tǒng)測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期正常人胚食管、胃、小腸和肝臟HCY-2陽(yáng)性反應(yīng)部位的灰度值，同時(shí)測(cè)定無(wú)細(xì)胞區(qū)域的灰度值為本底值，然后換算為相對(duì)含量（任意單位），每張切片隨機(jī)分析3個(gè)視野，每個(gè)樣本取3張切片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組相對(duì)含量以±s表示，采用One-way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1HCY-2在人胚食管的表達(dá)HCY-2在人胚食管發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其表達(dá)主要分布于食管黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖1、表1）。陽(yáng)性反應(yīng)由于強(qiáng)度不同而呈現(xiàn)不同顏色，由弱至強(qiáng)為淺黃色、黃色或深棕色，妊娠早期表達(dá)最弱，妊娠中期最強(qiáng)；妊娠早期與其他3個(gè)時(shí)期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），妊娠中期與妊娠晚期和近足月比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1　HCY-2在人胚食管的表達(dá)（ABC法染色，200×）

表1　不同發(fā)育時(shí)期正常人胚食管黏膜上皮細(xì)胞HCY-2的表達(dá)比較

2.2HCY-2在人胚胃的表達(dá)HCY-2在人胚胎胃發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其表達(dá)主要分布于胃黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖2、表2）。妊娠中期表達(dá)最弱，近足月最強(qiáng)；妊娠晚期與妊娠中期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），近足月與其他3個(gè)時(shí)期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2　HCY-2在人胚胃的表達(dá)（ABC法染色，200×）

表2　不同發(fā)育時(shí)期正常人胚胃黏膜上皮細(xì)胞HCY-2的表達(dá)比較

2.3HCY-2在人胚小腸的表達(dá)HCY-2在人胚小腸發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其表達(dá)主要分布于小腸黏膜上皮細(xì)胞和小腸腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖3、表3）。HCY-2在小腸黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)隨胚胎的發(fā)育而逐漸減弱，妊娠早期最強(qiáng)，近足月最弱；妊娠早期與妊娠晚期和近足月比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），妊娠中期與妊娠晚期和近足月比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3　HCY-2在人胚小腸的表達(dá)（ABC法染色，200×）

表3　不同發(fā)育時(shí)期正常人胚小腸黏膜上皮細(xì)胞HCY-2的表達(dá)比較

2.4HCY-2在人胚肝臟的表達(dá)HCY-2在人胚肝臟發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖4、表4）。HCY-2在肝細(xì)胞的表達(dá)隨著胚胎的發(fā)育而逐漸減弱，妊娠早期表達(dá)最強(qiáng)，近足月最弱；妊娠早期與其他3個(gè)時(shí)期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），妊娠中期與妊娠晚期和近足月比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），妊娠晚期與近足月比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4　HCY-2在人胚肝臟的表達(dá)（ABC法染色，200×）

表4　正常人胚發(fā)育不同時(shí)期肝臟細(xì)胞中HCY-2的表達(dá)比較

3　討　論

HCY-2是陳光慧等［6］用同型半胱氨酸刺激培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞而得到的4個(gè)新的cDNA序列之一。有研究發(fā)現(xiàn)，HCY-2與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［1，6］。HCY-2在成年SD大鼠的肝臟、肺臟、腎臟、心臟、血管、脊髓和腦組織等器官，以及在人胚心臟發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中均持續(xù)表達(dá)［3-4］，但是除心臟外，在胚胎發(fā)育時(shí)期的其他臟器中是否表達(dá)及表達(dá)情況尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCY-2在人胚食管、胃、小腸和肝臟發(fā)育的整個(gè)時(shí)期均表達(dá)，其表達(dá)蛋白主要分布在消化管的黏膜上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)，并且分布在細(xì)胞質(zhì)中。李英等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在成年SD大鼠中，HCY-2在功能活躍或分裂增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞的器官中表達(dá)較高，而在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中給予不同劑量的同型半胱氨酸刺激的相關(guān)研究顯示，HCY-2在培養(yǎng)的人胚心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)，其在心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，并伴隨細(xì)胞的增殖率升高，從而說(shuō)明高表達(dá)的HCY-2可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；HCY-2在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞低表達(dá)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)率隨之降低，從而說(shuō)明低表達(dá)的HCY-2對(duì)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有抑制作用［5］。在人胚食管、胃、小腸和肝臟發(fā)育的整個(gè)時(shí)期，參與構(gòu)成食管、胃、小腸和肝臟的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，此時(shí)，HCY-2持續(xù)表達(dá)。推測(cè)在人胚食管、胃、小腸和肝臟發(fā)育過(guò)程中，HCY-2的表達(dá)與組成食管、胃、小腸和肝臟的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖有關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以影響或調(diào)節(jié)人胚消化器官的發(fā)育。

有研究在雞胚中轉(zhuǎn)HCY-2時(shí)發(fā)現(xiàn)，HCY-2的異常表達(dá)可以導(dǎo)致雞胚包括心內(nèi)膜墊缺損的心臟結(jié)構(gòu)紊亂，同時(shí)還阻礙心室、心房的發(fā)育，以及心肌細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)水平發(fā)生改變［7-9］；在培養(yǎng)的人胚心肌細(xì)胞給予同型半胱氨酸刺激誘導(dǎo)HCY-2表達(dá)改變后，心肌細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)水平也發(fā)生變化［10］。HCY-2異常表達(dá)時(shí)雞胚心血管系統(tǒng)出現(xiàn)包括心臟過(guò)小、異位心和心外露等發(fā)育畸形。由此認(rèn)為，HCY-2的異常表達(dá)與胚胎畸形密切相關(guān)。在內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，HCY-2的正常表達(dá)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，然而，細(xì)胞凋亡對(duì)維持胚胎正常發(fā)育具有關(guān)鍵作用［11-12］。因此，推測(cè)HCY-2的表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡以調(diào)節(jié)人胚食管、胃、小腸和肝臟的發(fā)育。

陳光慧等［6］研究還發(fā)現(xiàn)，HCY-2為凋亡促進(jìn)基因。而王光明等［4］在對(duì)室間隔膜部缺損的人胚心臟的研究中發(fā)現(xiàn)，HCY-2的表達(dá)出現(xiàn)異常，推測(cè)在胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中，HCY-2可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡而參與心臟的分隔。另有研究顯示，HCY-2蛋白編碼的基因與受體相互作用蛋白家族3（receptor interacting proteins 3，RIP3）基因高度同源［10］，為RIP3的同源基因。RIP3基因可以激活半胱天冬酶-2，然后通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。在Hela細(xì)胞株中，當(dāng)RIP3基因沉默后，由于環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）不能被激活，從而使有cAMP和cGMP參與的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，細(xì)胞無(wú)法維持正常功能［14-15］。因此，在人體胚胎發(fā)育過(guò)程中，HCY-2的表達(dá)對(duì)食管、胃、小腸和肝臟正常結(jié)構(gòu)的形成具有重要作用，但是還有待于進(jìn)一步研究其具體作用機(jī)制：（1）在細(xì)胞水平分別研究食管、胃、小腸和肝臟HCY-2陽(yáng)性細(xì)胞在HCY-2表達(dá)改變時(shí)細(xì)胞增殖、形態(tài)的改變；（2）研究在食管、胃、小腸和肝臟畸形的胚胎中HCY-2的表達(dá)變化規(guī)律；（3）在動(dòng)物水平通過(guò)基因敲入和基因敲除技術(shù)使HCY-2表達(dá)異常，以研究食管、胃、小腸和肝臟的發(fā)育。這樣有可能完全闡明HCY-2在胚胎食管、胃、小腸和肝臟發(fā)育中的作用及其機(jī)制。

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Role of HCY-2 in normal human embryonic digestive system development

Zhang Yuanyuan1，Li Yaokang2，Wang Guangming2△（1.DepartmentofInternalMedicine；2.DepartmentofPathology，ClinicalCollege，DaliUniversity，Dali，Yunnan671000，China）

ObjectiveTo research the expression of homocysteine induced gene（HCY-2）in the main organs of esophagus，stomach，small intestine and liver during the human embryonic digestive system development and its role in digestive system development.MethodsThe different periods of normal developmental human embryonic esophagus，stomach，small intestine and liver were collected and the HCY-2 expression in these organs was semi-quantitatively analyzed by adopting the immunohistochemical avidin-biodin-peroxidase compound method and image analysis technique.ResultsHCY-2 was expressed during the whole development process of human embryonic esophagus，stomach，small intestine and liver.Different pregnant stages had different expression intensities.The expression protein was mainly distributed in the mucosal epithelial cells of digestive tube and hepatocytes，moreover in the cytoplasm.The expression of HCY-2 in esophageal mucosal epithelial cells was strongest in middle stage of pregnancy and weakest in the early stage of pregnancy；the expression of HCY-2 in the stomach mucosal epithelial cells wasstrongestnearfullterm andweakestin the middle stage ofpregnancy；the expression ofHCY-2in smallintestine mucosalepithelial cells and liver cells was attenuated gradually following embryo developing，which was strongest in the early pregnancy and weakest near full term.ConclusionHCY-2 could participate in the development of human embryonic digestive tube and digestive glands.

Homocysteine；Genes；Digestive system/embryology；Immunohistochemistry；Homocysteine induced gene 2；Human embryo；Digestive tube；Digestive gland

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.013

A

1009-5519（2016）01-0038-03

張?jiān)?974-），碩士研究生，副教授，主要從事內(nèi)科學(xué)教學(xué)與研究工作。

△，E-mail：420869015@qq.com。

（2015-10-25）