車(chē)江雁，王寶宏（.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊26000；2.濰坊市人民醫(yī)院，山東26000）

BCL2、BCL6、MUM1蛋白表達(dá)及其與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后的關(guān)系

車(chē)江雁1，王寶宏2△（1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261000；2.濰坊市人民醫(yī)院，山東261000）

目的探討彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）組織中MUM1、BCL2和BCL6蛋白的表達(dá)及其與DLBCL臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法收集山東省濰坊市人民醫(yī)院2010年2月至2014年2月80例有完整臨床和隨訪資料的新確診DLBCL患者的病理組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中BCL2、BCL6和MUM1蛋白的表達(dá)，分析其相互關(guān)系及其與DLBCL臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果80例DLBCL患者腫瘤組織中BCL2、BCL6及MUM1 3種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.2%（29/80）、65.0%（52/80）、77.5%（62/80）。MUM1陽(yáng)性組、陰性組患者平均生存期分別為35.4、51.7個(gè)月；BCL2陽(yáng)性組、陰性組患者平均生存期分別為35.7、47.2個(gè)月；BCL6陽(yáng)性組、陰性組患者平均生存期分別為54.5、35.1個(gè)月。MUM1陰性組、BCL6陽(yáng)性組患者預(yù)后相對(duì)較好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B(niǎo)CL2與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系尚不確切。結(jié)論MUM1、BCL2及BCL6蛋白表達(dá)情況為DLBCL的臨床治療和預(yù)后分析提供了重要信息，但目前對(duì)其作用機(jī)制尚缺乏了解，值得深入研究。

DNA結(jié)合蛋白質(zhì)類；原癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2；淋巴瘤，B細(xì)胞/病理學(xué)；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL）是一種大B細(xì)胞彌漫增生性惡性腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）中最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，占新診斷病例的30%～40%［1］。DLBCL的形態(tài)學(xué)、免疫表型、分子遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)極具異質(zhì)性，其傳統(tǒng)治療方案是以利妥昔單抗和蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的免疫化學(xué)療法，一些相關(guān)方案可以治愈60%～70%的患者［2］。盡管如此，患者對(duì)治療的反應(yīng)及預(yù)后仍存在較大差異，仍有較多患者對(duì)治療反應(yīng)差，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或進(jìn)展，預(yù)后不良［3］。近年來(lái)，國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評(píng)分已廣泛用于對(duì)DLBCL患者的預(yù)后評(píng)估，但是臨床研究發(fā)現(xiàn)，IPI評(píng)分相同的患者預(yù)后不盡相同［4］。近年來(lái)，BCL2、BCL6和MUM1等蛋白與DLBCL的發(fā)生及其與臨床預(yù)后的關(guān)系備受關(guān)注，然而分子遺傳學(xué)異常與臨床預(yù)后的關(guān)系存在爭(zhēng)議，了解其發(fā)病機(jī)制并尋找更好的治療方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本研究分析了BCL2、BCL6和MUM1 3種蛋白在80例DLBCL患者腫瘤組織中的表達(dá)，并對(duì)患者進(jìn)行跟蹤隨訪，從而為臨床治療及預(yù)后分析提供重要及客觀的依據(jù)。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1資料來(lái)源收集山東省濰坊市人民醫(yī)院2010 年2月至2014年2月80例有完整臨床和隨訪資料的新確診DLBCL患者的病理組織標(biāo)本進(jìn)行研究。

1.1.2試劑MUM1、BCL2、BCL6兔抗人單克隆抗體［一抗（ab32072、ab45413、ab203619、ab126593）］由艾美捷科技有限公司（Abcam公司）提供，羊抗兔多克隆抗體［二抗（BA1125）］由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1染色方法

1.2.1.1石蠟切片的制備與蘇木精-伊紅（hematoxylineosin staining，HE）染色組織標(biāo)本經(jīng)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行4 μm厚切片。將切片放入蘇木精中染色10～30 min，之后用自來(lái)水流水沖洗15 min，將切片放入1%鹽酸乙醇分化液中褪色，用5%伊紅乙醇染液對(duì)比染色2～5 min，HE染色完畢，切片室溫留存以進(jìn)行觀察。

1.2.1.2免疫組織化學(xué)染色制備的組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)脫蠟、水化后，采用Elivision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。MUM1、BCL2、BCL6作為陽(yáng)性對(duì)照，三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2結(jié)果判定根據(jù)DLBCL標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)清晰定位的棕褐色或棕黃色顆粒來(lái)判斷其陽(yáng)性表現(xiàn)。BCL2、BCL6及MUM1 3種已知標(biāo)志物應(yīng)用定性判斷，BCL2以定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)特異著色大于30%為陽(yáng)性；BCL6和MUM1為細(xì)胞核著色大于30%為陽(yáng)性。

1.2.3治療及隨訪80例患者采用利妥單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿聯(lián)合潑尼松（R-CHOP）方案治療，隨訪4～60個(gè)月。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各陽(yáng)性組與陰性組間比較采用χ2檢驗(yàn)；總生存期（overall survival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）分析采用Kaplan-Meier法；單因素生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1臨床資料和特征80例DLBCL患者中男49例，女31例；男女比例為1.6∶1；中位年齡53歲。腫瘤發(fā)生于淋巴結(jié)內(nèi)46例，淋巴結(jié)外34例。原發(fā)于淋巴結(jié)46例，胃8例，大腸7例，小腸7例，扁桃體4例，腮腺2例，睪丸、乳腺、胰腺、甲狀腺、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)各1例。根據(jù)Ann Arbor分期，Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期30例。乳酸脫氫酶（LDH）正常（＜240 U/L）44例，升高（≥240 U/ L）36例。IPI評(píng)分低于3分51例，≥3分29例。見(jiàn)表1。

2.2形態(tài)學(xué)表現(xiàn)46例原發(fā)于淋巴結(jié)DLBCL組織標(biāo)本多呈彌漫性生長(zhǎng)，正常淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)多不存在，腫瘤細(xì)胞增大，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞質(zhì)呈嗜酸或嗜雙色性，細(xì)胞核增大、偏位，可見(jiàn)一個(gè)或多個(gè)核仁，嗜酸或嗜堿性（圖1A箭頭所指），R-S細(xì)胞較為典型，核分裂象易見(jiàn)（圖1B箭頭所指），多數(shù)病例為一致的大B細(xì)胞形態(tài)；22例胃腸DLBCL組織標(biāo)本主要表現(xiàn)為彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞黏膜和腺體（圖1C箭頭所指）；其余病例組織標(biāo)本表現(xiàn)較不典型。

表1　DLBCL組織中3種蛋白表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

圖1　DLBCL腫瘤組織標(biāo)本HE染色結(jié)果（400×）

2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果BCL2為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著色（圖2A），BCL6（圖2B）和MUM1（圖2C）為細(xì)胞核著色。BCL2、BCL6及MUM1 3種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.2%（29/80）、65.0%（52/80）、77.5%（62/80），3種蛋白表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2　BCL2、BCL6及MUM1蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（400×）

2.43種蛋白表達(dá)與DLBCL患者生存期分析80例患者中死亡28例。BCL2陰性組與陽(yáng)性組患者平均生存期分別為47.2、35.7個(gè)月；BCL6陰性組與陽(yáng)性組患者平均生存期分別為35.1、54.5個(gè)月；MUM1陰性組與陽(yáng)性組患者平均生存期分別為51.7、35.4個(gè)月。BCL2表達(dá)與DLBCL患者OS具有相關(guān)性（P=0.001），陰性組患者預(yù)后較陽(yáng)性組好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與PFS無(wú)關(guān)（P=0.548）；BCL6表達(dá)與DLBCL患者OS及PFS均具有相關(guān)性（P=0.001、0.002），陽(yáng)性組患者預(yù)后較陰性組好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MUM1表達(dá)與DLBCL患者OS及PFS均具有相關(guān)性（P=0.001），陰性組患者預(yù)后較陽(yáng)性組好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表2。

圖3　BCL2、BCL6、MUM1陰性組和陽(yáng)性組患者OS與PFS Kaplan-Meier生存曲線比較

表2　DLBCL組織中3種蛋白表達(dá)與生存期的多變量分析

3　討　論

本研究通過(guò)檢測(cè)80例DLBCL患者腫瘤組織中BCL2、BCL6和MUM1 3種蛋白的表達(dá)情況對(duì)患者臨床特征進(jìn)行了比較，并對(duì)預(yù)后進(jìn)行分析。BCL2、BCL6及MUM1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.2%、65.0%和77.5%，3種蛋白表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MUM1陰性組和BCL6陽(yáng)性組患者預(yù)后相對(duì)較好（P＜0.05），而B(niǎo)CL2與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系尚不確切。

BCL2蛋白為一種抗凋亡蛋白，可調(diào)節(jié)線粒體、控制細(xì)胞色素C和其他凋亡因子的釋放，對(duì)抑制凋亡具有重要作用［5］。但是有研究發(fā)現(xiàn)，BCL2蛋白的表達(dá)僅與DLBCL的分型有關(guān)，而與患者預(yù)后無(wú)關(guān)［6-7］。本研究結(jié)果表明，BCL2陽(yáng)性表達(dá)主要發(fā)生于生發(fā)中心樣 B細(xì)胞（GCB）型DLBCL患者，與Ann Arbor分期、年齡、性別等無(wú)關(guān)（P＞0.05），與低危IPI評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），但Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析提示，BCL2的表達(dá)與DLBCL患者OS具有相關(guān)性（P=0.001），陰性組患者預(yù)后較陽(yáng)性組好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與患者PFS無(wú)關(guān)（P=0.548）。

BCL6是B細(xì)胞分化的抑制性基因，其低表達(dá)是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素，BCL6基因重排通過(guò)一系列調(diào)控機(jī)制，致使BCL6蛋白表達(dá)發(fā)生異常變化［8-10］。本研究結(jié)果顯示，BCL6陽(yáng)性表達(dá)患者多處于Ann Arbor分期的Ⅰ～Ⅱ期，與Ⅲ～Ⅳ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），與低危IPI評(píng)分、年齡、性別等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析，BCL6的表達(dá)與DLBCL患者OS及PFS均具有相關(guān)性（P=0.001、0.002），陽(yáng)性組患者預(yù)后較陰性組好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

MUM1為一種骨髓瘤相關(guān)基因，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，即淋巴細(xì)胞活化和B細(xì)胞分化中具有關(guān)鍵性作用，提示DLBCL患者的亞型non-GCB分型［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，86.7%（26/30）MUM1蛋白陽(yáng)性患者處于Ann-Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期，并且為高危IPI評(píng)分患者，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016），但與年齡、性別等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析，MUM1的表達(dá)與DLBCL患者的OS及PFS均具有相關(guān)性（P=0.001），陰性組患者預(yù)后較陽(yáng)性組好。與Hans等［12］研究發(fā)現(xiàn)MUM1陽(yáng)性患者預(yù)后較陰性患者差的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究對(duì)80例DLBCL患者采用R-CHOP方案治療，具有臨床治療的一致性，MUM1陰性組和BCL6陽(yáng)性組患者臨床特征和預(yù)后均相對(duì)較好，而B(niǎo)CL2與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系尚不確切。對(duì)于已經(jīng)確診為DLBCL的患者，BCL2、BCL6和MUM1 3種蛋白可以作為生物標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合分析，對(duì)患者的治療和預(yù)后可進(jìn)行更佳的選擇與判斷。

［1］Akyurek N，Uner A，Benekli M，et al.Prognostic significance of MYC，BCL2，and BCL6 rearrangements in patients with diffuse large B-cell lymphomatreated with cyclophosphamide，doxorubicin，vincristine，and prednisone plus rituximab［J］.Cancer，2012，118（17）：4173-4183.

［2］孫冠星，曹祥山，王志林，等.BCL-6、MYC和p53基因異常與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤免疫學(xué)亞型及預(yù)后的關(guān)系［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012，29（5）：576-581.

［3］Sehn LH，Berry B，Chhanabhai M，et al.The revised International Prognostic Index（R-IPI）is a better predictor of outcome than the standard IPI for patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP［J］. Blood，2007，109（5）：1857-1861.

［4］ Wilder RB，Rodriguez MA，Medeiros LJ，et al.International prognostic index-based outcomes for diffuse large B-cell lymphomas［J］.Cancer，2002，94（12）：3083-3088.

［5］Green DR，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］. Science，2004，305（5684）：626-629.

［6］Zeng LP，Wen YL，Ma Y，et al.Mechanism and clinical significance of antiapoptotic gene bcl-2 expression in diffuse large B-cell lymphoma［J］. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2011，40（6）：377-381.

［7］Visco C，Tzankov A，Xu-Monette ZY，et al.Patients with diffuse large B-cell lymphoma of germinal center origin with BCL2 translocations have poor outcome，irrespective of MYC status：a report from an International DLBCL rituximab-CHOP Consortium Program Study［J］.Haematologica，2013，98（2）：255-263.

［8］Copie-Bergman C，Gaulard P，Leroy K，et al.Immuno-fluorescence in situ hybridization index predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP：a GELA study［J］.J Clin Oncol，2009，27（33）：5573-5579.

［9］Sanders L，Jayne S，Kennedy B，et al.A Double Hit CD10-Negative BCell Lymphoma with t（3；8）（q27；q24）Leading to Juxtaposition of the BCL6 and MYC Loci Associated with Good Clinical Outcome［J］.Case Rep Hematol，2014，2014：120714.

［10］Iqbal J，Greiner TC，Patel K，et al.Distinctive patterns of BCL6 molecular alterations and their functional consequences in different subgroups of diffuse large B-cell lymphoma［J］.Leukemia，2007，21（22）：2332-2343.

［11］Rahimi H，Jafarian A，Samadi A，et al.Evaluation of BCL6 and MUM1 expression in patients with diffuse large B cell lymphoma and their correlations with staging and prognosis in Iran［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（1）：83-86.

［12］Hans CP，Weisenburger DD，Greiner TC，et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray［J］.Blood，2004，103（1）：275-282.

Expressions of BCL2，BCL6 and MUM1 protein and their relationship with prognosis of diffuse large B cell lymphoma

Che Jiangyan1，Wang Baohong2△（1.Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261000，China；2.Weifang Municipal People′s Hospital，Weifang，Shandong 261000，China）

ObjectiveTo investigate the expressions of MUM1，BCL2 and BCL6 protein in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）tissue and their relation with the DLBCL pathological characteristics and prognosis.MethodsThe pathological tissue samples in 80 cases of newly diagnosed DLBCL with intact clinical and follow up data in the Weifang Municipal People′s Hospital from February 2010 to February 2014 were collected.The immunohistochemistry technique was used to assess the expressions of MUM1，BCL2 and BCL6 protein in DLBCL tissue，then their mutual relationship and the relation with clinical pathological characteristics and prognosis were analyzed.ResultsThe positive expression rates of BCL2，BCL6，MUM1 protein in 80 cases of DLBCL were 36.3%（29/80），65%（52/80）and 77.5%（62/80）respectively.The average survival time in the MUM1 positive group and negative group were 35.4 months and 51.7 months respectively，which in the BCL2 positive group and negative group were 35.7 months and 47.2 months，which in the BCL6 positive group and negative group were 54.5 months and 35.1 months respectively.The BCL6 positive and MUM1 negative groups showed relatively better prognosis，the difference was statistically significant（P＜0.05）.But the relation between BCL2 and prognosis in the patients with DLBCL was still inexact.Conclusion The expression situation of MUM1，BCL2 and BCL6 protein provides the important information for clinical therapy and prognosis of DLBCL.But it is still a lack of understand on its action mechanism，which is worth deep research.

DNA-binding proteins；Proto-oncogene proteins c-bcl-2；Lymphoma，B-Cell/pathology；Immunohistochemistry；Prognosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.009

A

1009-5519（2016）01-0025-03

車(chē)江雁（1989-），碩士研究生，主要從事血液系統(tǒng)疾病及血液腫瘤的研究。

△，E-mail：77160520@qq.com。

（2015-10-14）