陸　淳,張　鑫,吳劍平,嚴(yán)　鳳,顧　欣

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海長寧201103)

抗病毒藥物在動物組織中殘留檢測方法進(jìn)展

陸淳,張鑫,吳劍平,嚴(yán)鳳,顧欣

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海長寧201103)

金剛烷類、神經(jīng)氨酸酶抑制劑、核苷類以及廣譜類的抗病毒藥物都曾被報道用于獸醫(yī)臨床治療病毒感染[1],我國農(nóng)業(yè)部2005年發(fā)出《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》要求禁止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用金剛烷胺等抗病毒藥物,美國FDA于2006年禁止金剛烷類和神經(jīng)氨酸酶抑制劑類抗流感病毒藥物用于禽類,但近年來為預(yù)防禽流感,抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)有濫用現(xiàn)象,2012年的"速成雞"事件中檢出雞肉中殘留有金剛烷胺和利巴韋林,給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的負(fù)面影響.抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的非法使用屢禁不止,而國內(nèi)外對動物組織中的抗病毒藥物多殘留的檢測方法研究較少,這給此類藥物的監(jiān)管帶來了不便,研究建立同時檢測多種抗病毒藥物殘留量的檢測方法,對于有效監(jiān)控該類藥物的使用、保障我國動物性食品安全具有重要的意義.本文在參考國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合自身工作實際,對目前常見四類8種抗病毒藥物殘留的LC/MS/MS檢測方法進(jìn)行綜述,為監(jiān)測部門提供參考.

1　抗病毒藥物的分類和機(jī)理

抗病毒藥在某種意義上說是病毒抑制劑,不能破壞病毒體,也不會損傷宿主細(xì)胞.抗病毒藥的作用在于抑制病毒的繁殖,使宿主免疫系統(tǒng)抵御病毒侵襲,修復(fù)被破壞的組織,緩和病情使之不出現(xiàn)臨床癥狀.本文關(guān)注的8種常用的抗病毒藥物分類及其作用機(jī)理各不相同.

1.1金剛烷胺類抑制病毒復(fù)制初期的藥物,阻斷病毒基因的脫殼即阻斷病毒核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞,達(dá)到治療和預(yù)防病毒感染疾病的目的,常見的有:金剛烷胺(Amantadine,ATD),金剛乙胺(Rimantadine,RTD),美金剛胺(Memantine,MMT)等.

1.2神經(jīng)氨酸酶抑制劑類神經(jīng)氨酸酶是流感病毒顆粒表面的一種由蛋白構(gòu)成的酶,是病毒復(fù)制和擴(kuò)散所最關(guān)鍵的酶,通過抑制神經(jīng)氨酸酶的活性,阻止子代病毒顆粒在宿主細(xì)胞的復(fù)制和釋放,可明顯縮短流感的持續(xù)時間,如奧司他韋(Os?eltamivir,OSTV)等.

1.3核苷類在病毒復(fù)制過程中,藥物競爭性地與病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相結(jié)合,從而抑制酶活性,干擾病毒核酸的合成,產(chǎn)生抗病毒作用,常見的有:利巴韋林(Ribavirin,RBV),阿昔洛韋(Acy?clovir,ACLV),更昔洛韋(Ganciclovir,GCLV)等. 1.4廣譜抗病毒類對流感病毒等多種病毒增殖期的各個環(huán)節(jié)都有作用,如嗎啉胍(Moroxy?dine,MXD)等.

2　抗病毒藥物的化學(xué)性質(zhì)

抗病毒藥物的水溶性(LogS)、水油分配系數(shù)(LogP)、解離系數(shù)(pKa)的理論值見表1,8種抗病毒藥物的水溶性和酸堿性不同,其中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛胺的性質(zhì)接近,均為極性中等,堿性化合物,易溶于甲醇和酸性水溶液,可在反相色譜柱上保留:利巴韋林、阿昔洛韋和更昔洛韋為兩性化合物,極性較大,易溶于水溶液,難在反相色譜柱上保留:嗎啉呱為堿性化合物,易溶于水,難在反相色譜柱上保留:奧司他韋為兩性化合物,易溶于甲醇,可在反相色譜柱上保留.

表1　8種抗病毒藥物的溶解度參數(shù)及解離系數(shù)

3　抗病毒藥物在動物體內(nèi)的殘留情況

不同的抗病毒藥物在體內(nèi)的代謝途徑及代謝產(chǎn)物均不相同,總體來看,8種抗病毒藥物在動物體內(nèi)均有原型存在,但含量高低不同.金剛烷胺90%以原型排出,金剛乙胺可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,包括間羥基化代謝物、2個對羥基代謝物的差向異構(gòu)體,以及它們與葡萄糖醛酸的結(jié)合物等[2-3].利巴韋林在動物體內(nèi)以原藥、單磷酸酯(RMP)、二磷酸酯(RDP)和三磷酸酯(RTP)等形式存在,其中以原型和RMP的代謝形式占多數(shù)[4-5].阿昔洛韋、更昔洛韋主要以原型經(jīng)腎排泄.嗎啉胍可廣泛分布于雞的體液與組織,主要是在肝臟中進(jìn)行乙?；纬蔁o活性的代謝產(chǎn)物,經(jīng)腎排泄[6].奧司他韋在胃腸道被迅速吸收,經(jīng)肝臟或腸壁酯酶迅速轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物奧司他韋羧酸鹽,至少75%的口服劑量以活性代謝產(chǎn)物、少量以原型的形式進(jìn)入體內(nèi)循環(huán).

有學(xué)者[12]討論了利巴韋林的原型及代謝物的檢測方法,發(fā)現(xiàn)酶解后雞肉中利巴韋林殘留量上升,本課題組將0.1%利巴韋林以飲水方式飼喂雞兩周,在雞肉中檢出較高濃度的利巴韋林原型,作為畜禽養(yǎng)殖禁用藥,檢出原型即可滿足監(jiān)管要求,因此在實際監(jiān)測工作中,可不采用酶解,簡化檢測步驟,節(jié)省工作時間.

4　抗病毒藥物殘留的前處理方法

抗病毒藥物的作用機(jī)理和理化性質(zhì)各異,傳統(tǒng)前處理方法具有一定選擇性,藥物回收率不一致,且動物組織中藥物殘留量低,經(jīng)過復(fù)雜的提取凈化去脂步驟后,回收率不高,目前的文獻(xiàn)報道[7-12]檢測雞肉中的抗病毒藥物殘留的方法多局限與某一類抗病毒藥物,對多種抗病毒藥物殘留的同時檢測報道較少,通常采用直接提取法、QuEChERS法、固相萃取柱法、固相萃取柱串聯(lián)法、柱切換法等進(jìn)行檢測.其中直接提取法雜質(zhì)去除不夠充分、QuEChERS法對部分藥物有吸附,柱串聯(lián)法、在線凈化法等是比較新穎的思路,值得探索.

4.1直接提取法目前在動物組織中金剛烷胺類殘留量的檢測方法主要采用直接提取法[7-8].本課題組使用酸性水溶液或酸性乙腈直接提取可以提取出所有藥物,但稀釋倍數(shù)較大,酸性乙腈提取后可氮吹濃縮,濃縮倍數(shù)增加的同時,基質(zhì)干擾也較大,因此對于多殘留檢測,直接提取法并不適用.

4.2QuEChERS法QuEChERS法是基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)的快速前處理方法,近期在獸藥殘留分析領(lǐng)域有較多應(yīng)用,有學(xué)者將其用金剛烷胺和氟喹諾酮類的同時提取凈化,取得較好效果[9].本課題組嘗試將其用于8種抗病毒藥物的同時提取,發(fā)現(xiàn)在酸性乙腈直接提取的基礎(chǔ)上加入C18粉和PSA會使基質(zhì)得到凈化,但同時導(dǎo)致藥物回收率有一定降低.

4.3固相萃取柱法采用SPE小柱可實現(xiàn)多種抗病毒藥物的同時提取凈化,并在凈化和濃縮方面均有較好效果[13],但問題的關(guān)鍵在于難以將金剛烷類和核苷類同時獲得較好的分析[14],且8種藥物的性質(zhì)差異較大,因此選用單一固相萃取柱無法將全部藥物都保留.

4.4固相萃取柱串聯(lián)法有學(xué)者[15]嘗試了HLB固相萃取柱和PBA固相萃取柱串聯(lián)使用,通過反相保留機(jī)理,將大部分中等極性和非極性的物質(zhì)保留在HLB柱上,目標(biāo)分析物利巴韋林在HLB上不保留,進(jìn)而流過HLB柱,在PBA柱上發(fā)生萃取吸附作用,進(jìn)而實現(xiàn)了凈化和富集,該思路適用于目標(biāo)較單一的藥物殘留分析.本課題組[16]通過考察不同固相萃取柱對藥物的保留和吸附性質(zhì),利用MCX和Hypercarb可分別實現(xiàn)對部分藥物的富集凈化的特性,將MCX固相萃取柱和Hypercarb固相萃取柱串接使用,實現(xiàn)了對8種抗病毒藥物的同時富集凈化,取得較好的效果.

4.5在線凈化法有學(xué)者[10]采用甲醇-1%三氯乙酸或乙腈提取動物源食品中金剛烷胺,提取液用陽離子交換在線凈化柱(Cyclone MCX)凈化,5%氨水-甲醇溶液將分析物洗脫轉(zhuǎn)入至Capcell Pak MG C18分析柱,經(jīng)色譜分離后,用串聯(lián)質(zhì)譜檢測,取得較好回收率,但對于多種抗病毒藥物殘留分析的適用性有待考察.

綜上,由于8種抗病毒藥物的性質(zhì)差異較大,傳統(tǒng)的、單一的方法難以實現(xiàn)同時提取、分析,可考慮采用固相萃取柱串聯(lián)法,充分去除基質(zhì)干擾,并使得溶劑能夠匹配LC/MS/MS的檢測.

5　抗病毒藥物殘留檢測的儀器方法

國外有學(xué)者[17]在使用SXC固相萃取柱串接PBA固相萃取柱對雞肉進(jìn)行凈化后,通過在線的柱切換使得7種目標(biāo)藥物分別在C18色譜柱和石墨化碳Hypercarb色譜柱上保留,實現(xiàn)多種抗病毒藥物的同時分析.綜合文獻(xiàn)報道,本課題組比較了4種色譜體系:親水色譜柱(HILIC)、反相色譜柱(HSS T3)、正相色譜柱(BEH Amide)、石墨化碳色譜柱(Hypercarb),采用不同的色譜柱和流動相體系,會影響藥物的保留時間、出峰順序、響應(yīng)值等,在反相柱體系中,利巴韋林和阿昔洛韋保留不佳,在1.2 min出峰,易受雜質(zhì)峰干擾:在親水色譜柱和正相色譜柱體系中金剛烷胺,金剛乙胺,美金剛胺,嗎啉胍,奧司他韋均在1.5～1.8 min出峰,易受雜質(zhì)峰干擾:在石墨化碳色譜柱體系中獲得了較滿意結(jié)果.

6　結(jié)論

我國禁止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用抗病毒藥物用于畜禽養(yǎng)殖,抗病毒藥物的種類繁多,作用機(jī)理各不相同,代謝物形式較多,殘留在動物體內(nèi)的抗病毒藥物及其代謝物對人類健康造成隱患,目前抗病毒藥物的殘留檢測是畜禽產(chǎn)品質(zhì)檢領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題,本文綜述了基于LC/MS/MS對多種抗病毒藥物同時檢測的方法,發(fā)現(xiàn)問題的難點(diǎn)在于:(1)動物組織中8種藥物的同步提取,固相萃取柱串聯(lián)法是目前最好的解決方法;(2)8種藥物在色譜柱上保留和分析,Hypercarb色譜柱能實現(xiàn)對藥物的較好保留;(3)動物組織中的抗病毒藥物殘留形態(tài)較多,可將原型作為檢測目標(biāo)以簡化操作.

通過深入分析了解抗病毒藥物的性質(zhì)和檢測方法,為實現(xiàn)對抗病毒藥物在畜產(chǎn)品質(zhì)量領(lǐng)域的有效監(jiān)控、杜絕抗病毒藥物的非法使用提供技術(shù)支持.

[1]孫雷,李丹,畢言鋒,等.抗病毒藥物的毒性及殘留檢測方法研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志,2013,10:57-61.

[2]Hoffman H E,Gaylord J C,Blasecki J W,et al.pharmacokinetics and metabolism of rimantadine hydrochloride in mice and dogs[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1988,32(11):1699-1704.

[3]賈薇.液質(zhì)聯(lián)用法分析生物樣品中四環(huán)素類藥物和金剛乙胺代謝物[D].沈陽:沈陽藥科大學(xué),2001.

[4]Lin C C,Lourenco D,Xu G,et al.Disposition and metabolic pro?files of[14C]viramidine and[14C]ribavirin in rat and monkey red blood cells and liver[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2004,48(5):1872-1875

[5]Lin C C,Yeh L T,Luu T,et al.Pharmocokinetics and metabo?lism of[14C]ribavirin in rats and cynomolgus monkeys[J].Antimi?crobial Agents and Chemotherapy,2003,47(4):1395-1398.

[6]于連智,張德新,廖靜華,等.鹽酸嗎啉胍在雞體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1994,04:422-426.

[7]尹暉,孫雷,畢言鋒,等.雞肉和雞蛋中金剛烷胺與金剛乙胺殘留檢測UPLC-MS/MS法研究[J].中國獸藥雜志,2014,06:32-35.

[8]魏秀麗,高迎春,陳玲,等.超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉組織中金剛烷胺殘留[J].中國獸藥雜志,2013,06:53-55.

[9]曲斌,朱志謙,陸桂萍,等.UPLC-MS/MS快速測定雞肉中金剛烷胺和氟喹諾酮類藥物殘留[J].中國獸藥雜志,2013,07: 50-54.

[10]艾連峰,馬育松,陳瑞春,等.在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中金剛烷胺的殘留[J].分析化學(xué),2013,08: 1194-1198.

[11]云環(huán),崔鳳云,嚴(yán)華,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J].色譜,2013,08:724-728.

[12]祝偉霞,楊冀州,袁萍,等.超高效親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測雞肉及其制品中的利巴韋林及其代謝物的總殘留量[J].色譜,2013,10:934-938.

[13]劉正才,楊方,余孔捷,等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞組織中5種抗病毒類藥物的殘留量[J].色譜,2012,12:1253-1259.

[14]邵琳智,姚仰勛,謝敏玲,等.親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物組織中金剛烷胺與利巴韋林[J].分析測試學(xué)報,2013,12:1448-1452.

[15]曲斌,朱志謙,陸桂萍,等.測定雞肉中利巴韋林殘留的固相萃取-UPLC-MS/MS法研究[J].中國家禽,2013,15:37-40.

[16]張鑫,吳劍平,嚴(yán)鳳,等.基于雙柱固相萃取-色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留[J].中國獸藥雜志,2015,09:45-50.

[17]Bjorn J A.Berendsen,Robin S.Wegh,Martien L.Essers,et al. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography cou?pled to tandem mass spectrometry[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2012,4024.

R 978.7

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0529-6005(2016)06-0066-03

2015-10-21

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃[滬農(nóng)青字(2014)第2-5號];上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項目[滬農(nóng)科攻字(2013)第6-9號]

陸淳(1959-),男,高級獸醫(yī)師,本科,研究方向為獸藥及飼料檢測,E-mail:m13032160666@163.com

張鑫,E-mail:xin_zh@yeah.net