林坤群,賀鑫晉,劉辰光,盧洪江,李寶鈞,孫子龍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西太谷030801)

氟暴露小鼠睪丸形態(tài)計量學(xué)研究

林坤群,賀鑫晉,劉辰光,盧洪江,李寶鈞,孫子龍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西太谷030801)

為了觀察小鼠氟中毒睪丸形態(tài)變化特點(diǎn),研究氟對睪丸的毒性影響,選用45只健康性成熟雄性昆明系小鼠,隨機(jī)分為對照組、低氟組(25 mg/L NaF)、高氟組(100 mg/L NaF),連續(xù)飼喂60 d,制作睪丸石蠟組織切片,H.E.染色后,顯微鏡下觀察曲細(xì)精管形態(tài)變化,通過定量分析方法探討氟對睪丸的毒性影響.結(jié)果表明,與對照組相比,低氟組和高氟組曲細(xì)精管半徑、面積以及曲細(xì)精管管腔半徑、面積均無顯著性差異(P>0.05);高氟組小鼠曲細(xì)精管細(xì)胞層數(shù)和厚度極明顯低于對照組(P<0.01);形態(tài)學(xué)觀察顯示,25 mg/L氟中毒小鼠睪丸生精細(xì)胞減少,100 mg/L NaF可導(dǎo)致生精細(xì)胞排列紊亂、各級生精細(xì)胞減少等.本試驗可為氟的雄性生殖毒性研究提供直觀、科學(xué)的參考.

氟中毒;睪丸;曲細(xì)精管;形態(tài)計量學(xué)

氟作為一種非常活潑的鹵族元素,以多種化合物形式存在于自然界中.由于其安全范圍極窄,稍有過量就會造成毒性作用,氟中毒已成為全世界廣泛存在的一種人畜共患性地方病,主要對動物的牙齒、骨骼造成損傷,引起氟斑牙、氟骨癥等癥狀[1].除此之外,關(guān)于氟對非骨相系統(tǒng)(如生殖、神經(jīng)、腎、肝、免疫等)影響的研究和報道越來越多[2].自1994年Freni[3]在一項生態(tài)學(xué)研究中提出,在一些地區(qū)總生育力和氟含量呈負(fù)相關(guān)性以來,越來越多的研究表明氟可引起生殖系統(tǒng)的損傷[4].本研究旨在通過對飲水染氟性成熟雄性小鼠的睪丸組織的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并測量其曲細(xì)精管半徑、管腔半徑、曲細(xì)精管面積等形態(tài)計量學(xué)指標(biāo),為氟的生殖毒性研究提供理論依據(jù)與參考.

1　材料與方法

1.1試驗材料45只昆明系雄性小鼠和飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,氟化鈉(NaF)、Bouin's固定液、乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅等由院實驗中心配制.

1.2方法

1.2.1動物模型的建立小鼠購回后進(jìn)行一周的適應(yīng)性飼養(yǎng),隨機(jī)分成3個組,進(jìn)行分籠飼養(yǎng),依次為對照組,低氟組,高氟組,每組15只.進(jìn)行如下處理:對照組,飲用蒸餾水;低氟組飲用氟化鈉濃度為25 mg/L的蒸餾水;高氟組飲用氟化鈉濃度為100 mg/L的蒸餾水.自由采食、飲水.

1.2.2樣本采集及切片制作飼喂60 d后脫頸椎處死,迅速取其左側(cè)睪丸組織,生理鹽水沖洗,置于Bouin's固定液中固定24 h,自來水沖洗12 h,梯度酒精逐步脫水,置二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、展片、烘片.染色前,脫蠟、染色、透明,中性樹膠封片,于光鏡下觀察睪丸組織形態(tài).

1.2.3統(tǒng)計分析每組切片取30個曲細(xì)精管,用Image-Pro Plus5.0進(jìn)行測量,使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA顯著性檢驗.P< 0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著.

2　結(jié)果與分析

2.1睪丸形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)小鼠曲細(xì)精管細(xì)胞層的層數(shù)、厚度的分析結(jié)果見圖1.隨著氟化鈉劑量的增加,曲細(xì)精管細(xì)胞層的層數(shù)和厚度逐漸減少,且高氟組極顯著低于對照組(P<0.01).小鼠曲細(xì)精管半徑、面積,管腔半徑、面積的分析結(jié)果見圖2、3.與對照組相比,氟組小鼠睪丸曲細(xì)精管半徑、曲細(xì)精管面積,管腔半徑、管腔面積沒有顯著變化.

2.2睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化對照組的曲細(xì)精管細(xì)胞排列有序,各級生精細(xì)胞分布均勻(見中插彩版圖4A).25 mg/L氟中毒小鼠睪丸生精細(xì)胞減少(見中插彩版圖4B),100 mg/L氟化鈉可導(dǎo)致生精細(xì)胞排列紊亂、各級生精細(xì)胞減少(見中插彩版圖4C).氟對睪丸組織的損傷存在劑量效應(yīng)關(guān)系,隨著氟化物的增加,曲細(xì)精管的損傷程度越明顯.

3　討論

睪丸組織主要是由生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞組成,從上皮基部到腔面依次為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子.睪丸內(nèi)有大量彎曲的曲細(xì)精管,其是產(chǎn)生精子的場所,良好的睪丸組織、結(jié)構(gòu)對于精子的發(fā)生和生理功能的維持具有決定性意義.如果曲細(xì)精管內(nèi)生精上皮受到化學(xué)毒物的影響,精子發(fā)生將出現(xiàn)障礙.

圖1　不同濃度氟的小鼠曲細(xì)精管細(xì)胞層數(shù)(A)、厚度(B)

圖2　不同濃度氟的小鼠曲細(xì)精管管腔半徑(A)、面積(B)

圖3　不同濃度氟的小鼠曲細(xì)精管半徑(A)、面積(B)

研究證明,氟是一種具有生殖毒性的微量元素.當(dāng)體內(nèi)氟蓄積到一定的濃度,會突破了血睪屏障,對睪丸的生精功能產(chǎn)生毒副作用[5].氟對大鼠睪丸生長發(fā)育的毒性試驗中組織病變包括精原細(xì)胞損傷,精原細(xì)胞減少,以及嚴(yán)重的睪丸超微結(jié)構(gòu)的改變[6].飼喂含不同比例的燃煤型氟中毒病區(qū)煤烘玉米,發(fā)現(xiàn)大鼠睪丸生精小管發(fā)生不同程度的損害[7].Wan等[8](2006)用氟濃度為150 mg/L喂養(yǎng)大鼠50、80、100、120 d,隨著攝氟時間延長,小鼠生精上皮細(xì)胞層數(shù)目逐漸減少,曲細(xì)精管直徑越來越小.本試驗中高氟組小鼠的生精上皮細(xì)胞層數(shù)目減少,曲細(xì)精管管壁變薄同樣證實了這一觀點(diǎn);而25 mg/L與100 mg/L氟化鈉組小鼠的管腔半徑、曲細(xì)精管半徑、曲細(xì)精管面積、曲細(xì)精管管腔面積并沒有顯著差異,可能與試驗動物的種類、攝氟的劑量、時間、方式有關(guān)系,還需做進(jìn)一步試驗驗證.精子是精子發(fā)生的終末環(huán)節(jié),我們前期研究發(fā)現(xiàn)氟暴露造成附睪中成熟精子頭、尾部中段不同程度的結(jié)構(gòu)改變,尤以線粒體異常為主[9].本試驗通過睪丸形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的測定和形態(tài)學(xué)觀察,證實氟中毒可導(dǎo)致小鼠曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂、細(xì)胞層數(shù)顯著減少、厚度變薄,睪丸結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的破壞進(jìn)一步引起功能的紊亂和喪失,最終造成不育的發(fā)生.

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S859.8

B

0529-6005(2016)06-0102-02

2015-01-25

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金(2012-1403120005);山西省青年科技研究基金(2012021027-5);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動項目(XB2010003)

林坤群(1993-),男,本科生,就讀于動物生殖毒理學(xué)專業(yè)學(xué)習(xí),E-mail:405062446@qq.com

孫子龍,E-mail:sunzilong2000@163.com.