王　鋼,賀　筍,侯　鳳,李新萍,李延濤

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊830000)

豬肺炎支原體CJ株膜蛋白的電泳分析和免疫印跡檢測

王鋼,賀筍,侯鳳,李新萍,李延濤

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊830000)

以在新疆昌吉某豬場分離的一株豬肺炎支原體(CJ)為試驗(yàn)材料,采用SDS-PAGE和Western-Blot印跡對該菌的膜蛋白進(jìn)行了分析.該豬肺炎支原體(CJ)經(jīng)過Friis改良液體培養(yǎng)基培養(yǎng),以12 000 r/min離心收集菌體,低溫反復(fù)凍融獲得膜蛋白后,應(yīng)用12%分離膠,4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE分離,在電泳圖譜上呈現(xiàn)大概26條蛋白條帶,分子量在10 kD～200 kD.再以膜蛋白做免疫印跡檢測,其Western-Blot膜上有14種反應(yīng)條帶,其中p36、p38、p40、p52、p65,p70、p114、p200條帶顏色較深.

豬肺炎支原體;膜蛋白;SDS-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳;蛋白免疫印跡

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mph)引起的豬支原體肺炎遍布世界各地,并且在豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的發(fā)生中起到重要的作用[1].已有很多研究報道證明,豬肺炎支原體致病因子和主要抗原位于細(xì)胞膜上,而不是在細(xì)胞質(zhì)[2].本研究以新分離的豬肺炎支原體CJ株為試驗(yàn)材料,采用SDS-PAGE和Western-Blot印跡法對該菌膜蛋白進(jìn)行了分析,為下一步對動物的免疫原性和致病性研究提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料菌種:豬肺炎支原體CJ株,由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司保存.Friis改良液體培養(yǎng)基:Hanks A,Hanks B,酵母浸出液,PPLO和BHI粉末,豬血清,5%酚紅,抗生素(桿菌肽、甲氧西林),pH值在7.38～7.40.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)MARKER,購自賽默飛科技有限公司.4x Pro?tein SDS-PAGE Loading Buffer,購自TaKaRa公司.豬陽性血清:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司保存.羊抗豬IgG酶標(biāo)抗體:BETHHYL公司生產(chǎn),Cat:A100-105 P;Lot:A100-105P-22.高速冷凍離心機(jī):日本日立.電泳儀以及電泳槽:購自伯樂公司.

1.2豬肺炎支原體的培養(yǎng)、收集及膜的制備豬肺炎支原體CJ菌株按1∶10接種量加入培養(yǎng)基中,37℃搖床(50 r/min)培養(yǎng)并傳代,培養(yǎng)液顏色變黃,pH值大約為6.7時,取10 mL菌液12 000 r/min離心30 min,收獲菌體細(xì)胞,并用PBS(pH值7.2)洗滌幾次,最后用1 mL PBS溶解.然后采用-20℃低溫反復(fù)凍融3～4次,即制得膜蛋白(測膜蛋白量大約為5.68 mg/mL),-20℃保存?zhèn)溆?

1.3SDS-PAGE分離豬肺炎支原體膜蛋白采用垂直板型不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng),分離膠為12%,濃縮膠為4%制備凝膠.膜蛋白樣品與4XSDS混合,煮沸5分鐘,每孔20 μL量加入;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白按10 μL量加入.連接電源,電壓為150 V,待指示染料遷移距下沿約為1 cm時,停止電泳.取出部分進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測,其余未染色凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.

1.4膜的轉(zhuǎn)移將裁剪好的NC膜依次通過甲醇、去離子水、電轉(zhuǎn)液進(jìn)行激活,并將未染色的凝膠一起浸泡與電轉(zhuǎn)液中,裝配成"凝膠三明治",插入電泳轉(zhuǎn)移槽.NC膜接正極,凝膠接負(fù)極,連接電泳儀,調(diào)節(jié)電流為0.35 mA,電泳50 min,轉(zhuǎn)移完畢,取出膜.

1.5Western-Blot印跡將轉(zhuǎn)移電泳后的NC膜置PBST(含0.05%Tween-20)中,每次3 min,洗3次.置于封閉液內(nèi),在37℃搖床中保溫1 h,PBST再洗3次.加入1∶40稀釋的一抗,在37℃搖床中保溫1 h,取出PBST洗3次.再加入1∶5 000稀釋的羊抗豬IgG酶標(biāo)抗體,37℃保溫1 h,取出PBST洗3次.最后用DAB顯色,暗處反應(yīng)大概1～3 min,出現(xiàn)顯色條帶,終止反應(yīng),避光晾干,拍照.

2　結(jié)果

2.1SDS-PAGE結(jié)果豬肺炎支原體膜蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后,電泳圖譜上呈現(xiàn)約26條帶.相對分子量質(zhì)量范圍在10～200 kD,電泳圖譜見圖1.

圖1　豬肺炎支原體SDS-PAGE

2.2Western-Blot印跡結(jié)果樣品經(jīng)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),在26條膜蛋白中出現(xiàn)了14條顯色條帶,其中包括了p36、p38、p40、p41、p52、p65,p70、p97、p114、p200等主要蛋白.結(jié)果見圖2

圖2　豬肺炎支原體Western-Blot

3　討論

3.1豬肺炎支原體膜蛋白的電泳分離分析通過SDS-PAGE和Western-Blot技術(shù)分析微生物的蛋白和抗原組成是目前最常用的方法. Young[4]通過SDS-PAGE分析MPH J株,獲得15-20條譜帶.Geary[2]通過此方法檢測到豬肺炎支原體VPP11膜制劑得23條帶.邵國青[4]等通過SDSPAGE分析豬肺炎支原體168株,得到15條帶.張映[5]用12.5%凝膠對膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離,在電泳圖譜上呈現(xiàn)36條蛋白條帶.本試驗(yàn)通過SDS-PAGE方法獲得了26條譜帶,分子量在10 kD～200 kD之間,與文獻(xiàn)報道有些差異,可能與膜制劑的制備和菌種不同有關(guān).

3.2豬肺炎支原體膜蛋白的免疫印跡檢測WISE等[6]用免疫印跡方法檢測MPh J(ATCC25934)膜蛋白,結(jié)果表明,p70、p65、p50和p44這4種蛋白具有抗原性,并且證明這4種蛋白為膜完整蛋白. Scarman[8]通過用MPh豬高免血清做免疫印跡檢測,證明主要Mph抗原蛋白分子量大約為:36、43、48、52、76、78、80、82、94、106、114、200 kD.邵國青[4]通過對豬肺炎支原體168株免疫印跡分析,分子量約為36、41、50、64 kD的條帶較為明顯.張映[7]分析豬肺炎支原體Z株,其中p34、p47、p52、p54的酶染色帶顏色較深.本試驗(yàn)Western-Blot結(jié)果中,分子量為p36、p38、p40、p41、p52、p65,p70、p114、p200條帶反應(yīng)明顯,可以說明豬肺炎支原體CJ株具有免疫反應(yīng)的蛋白條帶較多,是潛在的候選免疫抗原.

[1]趙德明,張仲秋,沈建忠,主譯.豬病學(xué)[M].9版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2008:795-799.

[2]Geary S J,Walczak E M.Isolation of a cytopthic factor from My?coplasma hyopneumoniae[J].Infect Immun,1985,48:576-578.

[3]Young T F,Ross R F.Assessment of antibody response of swine infected with Mycoplasma hyopneumoniae by immunoblotting[J]. AmJ Vet Res,1987,48(4):651-656.

[4]邵國青.豬肺炎支原體168菌株蛋白SDS-PAGE譜帶和染色體DNA PFGE圖譜比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,1999,15(4):247-249.

[5]張映,王肇悅,舜向庭.豬肺炎支原體膜蛋白的電泳分析及免疫印跡檢測[J].畜牧獸醫(yī),2003,35(5):6-8.

[6]Wise K S.Major membrane surface proteins of mycoplasma hyo?pneumoniae selectively modified by covalently bound lipid[J].Bac?teriol,1987,169:5546-5555.

[7]Scarmam A L,Chin J C,Eamens G J,et al.Identification of nov?el species-specific antigens of Mycoplasma hyopneumoniae by preparative SDS-PA GE ELISA profiling[J].Microbiology,1997,143:663-673.

S858.28

A

0529-6005(2016)06-0041-02

2013-09-16

王鋼(1986-),男,碩士,主要從事獸用生物制品研究,E-mail:ganggang6666666@163.com