梅雪芳,楊　磊,陶　立,李　健,黃維義,王冬英

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005;2.廣西大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究中心,廣西南寧530005;3.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧530001)

黑山羊源野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)ITS2基因序列測(cè)定及分析

梅雪芳1,2,楊磊1,2,陶立3,李健1,2,黃維義1,2,王冬英1,2

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005;2.廣西大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究中心,廣西南寧530005;3.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧530001)

對(duì)首次分離自黑山羊的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)(Homalogaster paloniae)進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)觀察,擴(kuò)增其核糖體內(nèi)第二間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)基因序列(the second internal transcribed spacer,ITS2)并測(cè)序,獲得的序列經(jīng)DNAStar軟件處理和人工校對(duì)后,得到其精確的ITS2基因序列,長(zhǎng)度為295 bp,上傳至GenBank后獲得的登錄號(hào)為KJ561151.測(cè)序結(jié)果經(jīng)對(duì)比分析后顯示與分離自印度的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)(GU133056)ITS2基因片段序列一致性為100%.與分離自日本的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)(AB042190)ITS2基因序列一致性為99%,僅在第69個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)差異.

黑山羊;野牛平復(fù)盤(pán)吸蟲(chóng);ITS2

近年來(lái)隨著市場(chǎng)對(duì)黑山羊需求的增加,廣西的黑山羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,但寄生蟲(chóng)病長(zhǎng)期阻礙草食獸的養(yǎng)殖.野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)是寄生在牛羊的盲腸的一種同盤(pán)類(lèi)吸蟲(chóng)(也稱(chēng)作前后盤(pán)吸蟲(chóng)),分布于亞洲各地[1],我國(guó)眾多省份均有分布記載[2].野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)的自然終末宿主為黃牛、水牛、山羊和綿羊等,Islam[3]等人報(bào)道,水牛感染野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)后出現(xiàn)盲腸充血、淤血和嚴(yán)重的卡他性腸炎等癥狀.此前未見(jiàn)黑山羊感染該吸蟲(chóng)的報(bào)道,本次從廣西某黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)的死亡黑山羊中分離該蟲(chóng),進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定后對(duì)其核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄第二間隔區(qū)(internal transcribed spacer region 2,ITS2)序列進(jìn)行測(cè)定并分析,為今后該蟲(chóng)引發(fā)的疾病進(jìn)行分子診斷提供了合適的分子標(biāo)記.

1　材料與方法

1.1蟲(chóng)體來(lái)源2010年剖檢某黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)死亡黑山羊1頭,從其盲腸處檢獲數(shù)條腸吸蟲(chóng),將3蟲(chóng)體使用5%福爾馬林液壓片后,保存于10%福爾馬林液中,其余蟲(chóng)體觀察后均直接保存于70%乙醇中,備用.

1.2主要試劑卡紅(Sigma公司);Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DNA標(biāo)志物(DL-2 000)和pMD18-T載體,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA提取試劑盒(DNeasy Blood&Tissue kit),購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司;膠回收試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;人工胃蛋白酶,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.

1.3方法

1.3.1鹽酸卡紅染色觀察吸蟲(chóng)形態(tài)取出保存于10%福爾馬林液的蟲(chóng)體2條,按孔繁瑤[4]記述的鹽酸卡紅染色法對(duì)吸蟲(chóng)進(jìn)行染色,透明后使用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片,置于顯微鏡下對(duì)吸蟲(chóng)的內(nèi)部器官形態(tài)進(jìn)行觀察,并拍照.

1.3.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序取單條蟲(chóng)體,按照DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取蟲(chóng)體基因組DNA,依據(jù)Goswami[5]等的研究設(shè)計(jì)的引物,用以擴(kuò)增野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)的ITS2基因序列.上游引物(3S):5′-GG?TACCGGTGGATCACTTCGGCTCGTG-3′;下游引物(28R):5′-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3′),回收擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)pMD18-T載體克隆后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.3.3序列分析測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件校正處理,于NCBI進(jìn)行BLAST分析(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi).

2　結(jié)果

2.1蟲(chóng)體形態(tài)觀察對(duì)封片標(biāo)本進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),其形態(tài)構(gòu)造與陳心陶[2]描述的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)相同,據(jù)此將本次在黑山羊盲腸中分離到的吸蟲(chóng)鑒定為野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng),本文對(duì)其形態(tài)不作贅述(見(jiàn)中插彩版圖1).

2.2蟲(chóng)體ITS2基因測(cè)序結(jié)果PCR擴(kuò)增野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)ITS2基因,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,所獲得的條帶約為500 bp,與預(yù)期的目的片段一致.測(cè)序后獲得的序列經(jīng)人工校正后獲得野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)精確的ITS2片段,大小為295 bp,GC含量為52%.提交至GenBank后獲得登錄號(hào)為KJ561151.

2.3序列分析結(jié)果測(cè)序結(jié)果經(jīng)對(duì)比分析后結(jié)果顯示與分離自印度的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)(GU133056) ITS2基因片段序列一致性為100%.與分離自日本的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)(AB042190)ITS2基因序列一致性為99%,在第69個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)差異.

3　討論

野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)隸屬于腹殖目(Digenea)同盤(pán)總科(Paramphistomoidea)腹盤(pán)科(Gastrodisci?dae)平腹屬(Homalogaster)[6].此前由于同盤(pán)類(lèi)吸蟲(chóng)蟲(chóng)體較肥厚,不便于進(jìn)行常規(guī)的染色觀察,分類(lèi)鑒定工作較為繁雜,現(xiàn)今可通過(guò)分子生物學(xué)的方法選擇合適的分子標(biāo)記可彌補(bǔ)這一不足.吸蟲(chóng)的ITS2基因序列現(xiàn)被認(rèn)為是分子鑒定吸蟲(chóng)種類(lèi)時(shí)可信度最高的序列工具,已在同盤(pán)類(lèi)吸蟲(chóng)的分子鑒定中得到運(yùn)用[7].本文通過(guò)對(duì)黑山羊源的野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)ITS2基因序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序分析,進(jìn)一步支持了ITS2在吸蟲(chóng)的分子鑒定中是合適的分子標(biāo)記.

圖2　野牛平腹盤(pán)吸蟲(chóng)ITS2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

[1]Yamaguti S.System Helminthum Vol.1.The digenetic trematode of verterbrates[M].New York,Interscience,1958:971-972.

[2]陳心陶.中國(guó)動(dòng)物志吸蟲(chóng)綱復(fù)殖目(一)[M].北京:科學(xué)出版社,1985:230-231.

[3]Islam S,Chakraborty A,Das M.Pathological studies of caecum in concurrent infection of Homalogaster paloniae and Schistosoma in?dicum in bovine[J].Journal of Veterinary Parasitology,1990,4 (1):45-48.

[4]孔繁瑤.家畜寄生蟲(chóng)學(xué)[M].2版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1997:378.

[5]Goswami L M,Prasad P K,Tandon V,et al.Molecular Character?ization Of Gastrodiscoides hominis(Platyhelminthes:Trematode: Digenea)Inferred From ITS Rdna Sequence analysis[J].Parasitology Research,2009,104(6):1485-1490.

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[7]李健,全琛宇,石云良,等.食蟹猴體內(nèi)瓦氏瓦特松吸蟲(chóng)ITS序列測(cè)定及其種系發(fā)育分析[J].國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)病雜志,2013,6(40):305-310.

Thesequencing and analysis ofHomalogaster paloniaeITS2 geneisolated from black goat

MEI Xue-fang1,2,YANG Lei1,2,TAO Li3,LI Jian1,2,HUANG Wei-yi1,2,WANG Dong-ying1,2
(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 53005,China;2.Research Center of Food Quality and Safety,Guangxi University,Nanning 530004,China;3.Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning 530004,China)

We observed the morphology of the Homalogaster paloniae isolated from black goat of Guangxi,and then amplified and sequenced the second internal transcribed spacer.The sequence were analyzed by softwares of DNAstar and checked by artifi?cial.Then,we acquired the accurate ITS2 sequence,and its length was 295 bp.We submitted the sequence to the GenBank and the accession number was KJ561151.Compared with the Homalogaster paloniae isolated from India and Japan,we found that the homology were 100%and 99%,respectively.The sequence had one mutation at the 69 th point when compared with the parasite isolated from Japan.

Black goat;Homalogaster paloniae;ITS2

s:LI Jian;HUANG Wei-yi;WANG Dong-ying

S858.27

A

0529-6005(2016)06-0031-02

2014-09-16

梅雪芳(1990-),女,碩士生,研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī),E-mail:384280442@qq.com

李健,E-mail:leejianshin@163.com;黃維義,E-mail: wyhuang@gxu.edu.cn;王冬英:E-mail:dywang@gxu.edu.cn