王晨曦,張谞霄,孫洪磊,蒲　娟

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193)

北美H7亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法的建立

王晨曦,張谞霄,孫洪磊,蒲娟

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193)

本研究通過分析NCBI數據庫中H7亞型禽流感病毒HA基因序列,根據該基因設計引物,建立了針對北美H7亞型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR檢測方法,并對反應條件進行了優(yōu)化.該方法可特異地檢出北美H7亞型禽流感病毒HA基因,而未檢出歐亞分支H7亞型禽流感病毒H7N2和H7N9、其他亞型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H5N8和H9N2),以及新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒;檢測方法的靈敏度可達0.1 pg/μL.該檢測方法的建立為監(jiān)測北美H7亞型禽流感病毒提供了良好的技術支撐,可用于外來禽流感病毒的檢測.

H7亞型禽流感病毒;北美分支;HA;RT-PCR

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于正黏病毒科流感病毒屬,是一種呈球形或桿狀、有包膜的單股負鏈RNA病毒,其基因組由8個節(jié)段組成.依據病毒表面的血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白抗原性的不同,甲型流感病毒可分為18個HA亞型(H1～H18)和11個NA亞型(N1～N11)[1].根據病毒對雞的致病性,可分為低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)病毒和高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)病毒,其中HPAI由H5或H7亞型病毒引起.與其他禽流感病毒相似,根據HA基因的分子遺傳進化特點,H7亞型禽流感病毒可以分為兩個進化分支:歐亞分支和北美分支[2].

自1963年英國火雞發(fā)生H7N3亞型HPAI以來,先后有H7N3、H7N7、H7N4、H7N1、H7N2多種亞型流感病毒在雞、火雞、鴨、鵪鶉等多個品種的家禽中發(fā)生[3].除了亞型組合方式多樣化、感染宿主種類多之外,H7亞型禽流感病毒的地理分布也非常廣泛,歐洲、加拿大、美國等歐美國家是H7亞型禽流感病毒的高發(fā)地區(qū)[4].近年來,H7亞型流感病毒,特別是新型H7N9流感病毒感染人的報道引發(fā)了人們的廣泛關注[5].研究表明,北美分支的H7亞型禽流感病毒相比于歐亞分支的H7亞型禽流感病毒獲得了更強的α-2,6唾液酸糖苷結合能力[6],而α-2,6唾液酸糖苷正是人類上呼吸道主要分布的流感病毒受體[7],這可能增強該類病毒跨物種感染.動物試驗也證實部分北美分支H7亞型禽流感病毒能夠在雪貂間接觸傳播[8].因此,北美分支H7亞型禽流感病毒的公共衛(wèi)生學意義更值得關注.

目前為止,我國尚未有人或禽類感染北美H7亞型流感病毒的報道,但是禽產品貿易交流以及候鳥遷徙都可能將北美源H7亞型禽流感病毒傳入我國.因此建立一種針對北美H7亞型流感病毒的檢測方法并開展監(jiān)測十分重要.本研究我們建立了針對北美H7亞型禽流感病毒HA基因的RT-PCR檢測方法,并對該方法的特異性和敏感性進行了優(yōu)化和評價,該方法的建立對監(jiān)測北美源H7亞型禽流感病毒入境傳播具有重要意義.

1　材料與方法

1.1質粒北美H7亞型流感病毒A/New York/ 107/2003(H7N2)和A/mallard/Ohio/11OS2010/2011 (H7N8)HA基因質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.

1.2病毒A/California/04/2009(H1N1)、A/duck/ Anhui/D293/2014(H3N2)、A/chicken/Shandong/16/05 (H9N2)、新城疫病毒LaSota和雞傳染性支氣管炎病毒H120等由本實驗室分離和/或保存.H5N1禽流感病毒、歐亞分支H7N2病毒和H7N9病毒等的診斷抗原,購自哈爾濱維科生物制品有限公司.

1.3試劑TRIZol,購自Invitrogen公司;Taq Mix、Trans DNA Marker I,購自北京全式金生物技術有限公司;反轉錄流感特異性引物為Uni 12:5′-AG?CAAAAGCAGG-3′,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;反轉錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit,購自Thermo公司.

1.4引物設計與合成參照GenBank已發(fā)布的H7亞型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列,利用MEGA4.1和Primer Premier 5.0針對北美源H7亞型禽流感病毒保守區(qū)域設計引物.引物序列分別為,F:5′-CAAACAGAAAAGCCTCCTTCTGGCT-3′; R:5′-GTCTTTGTACCCACTACTCAACTTC-3′;擴增片段大小約590 bp.引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成.

1.5總RNA提取及反轉錄TRIZol法分別提取H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2亞型流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的總RNA.按照試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA,用于PCR擴增.

1.6PCR擴增PCR反應體系如下:2XMix Buffer 12.5 μL;Primer-F 0.5 μL;Primer-R 0.5 μL;cDNA 2 μL;加雙蒸水至終體積為25 μL,混勻.PCR反應程序為:94℃5 min;94℃30 s;58℃30 s; 72℃1 min;72℃10 min;4℃保存.從第二步至第四步反應進行29個循環(huán).反應結束后,取3 μL產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測.

1.7反應條件的優(yōu)化(1)退火溫度的優(yōu)化:分別以50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃為退火溫度進行PCR反應,以確定最佳的退火溫度;(2)延伸時間的優(yōu)化:分別以30、40、50、60 s為延伸時間進行PCR反應,以確定最佳的延伸時間;(3)優(yōu)化循環(huán)次數:分別以26、27、28、29、30為循環(huán)次數進行PCR反應,以確定最佳的循環(huán)次數.

1.8特異性試驗用建立的RT-PCR方法分別對北美H7N2禽流感病毒HA質粒、H7N8禽流感病毒HA質粒,及歐亞分支H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒進行檢測,并設置陰性對照,以評價該方法的特異性.

1.9敏感性試驗將北美H7亞型禽流感病毒A/ New York/107/2003(H7N2)HA質粒稀釋至10 ng/ μL,再依次進行10倍倍比稀釋,作為模板進行RT-PCR擴增,評價該方法的敏感性.

2　結果與分析

2.1RT-PCR檢測方法的建立

2.1.1退火溫度的優(yōu)化分別以50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃的退火溫度進行PCR反應,結果表明,最佳退火溫度為58℃,此時條帶清晰明亮,無拖帶或引物二聚體.

2.1.2延伸時間的優(yōu)化分別以30、40、50、60 s為延伸時間進行PCR反應,結果表明,最佳延伸時間為60 s,此時條帶最亮.

2.1.3循環(huán)次數的優(yōu)化分別以26、27、28、29、30 s的循環(huán)次數進行PCR反應,從減少檢測時間方面考慮,循環(huán)數越少越好,結果表明,最佳循環(huán)次數為29.

2.2特異性評價用建立的RT-PCR方法分別對北美H7N2亞型和H7N8亞型禽流感病毒HA質粒,及歐亞分支H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2亞型流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒進行檢測,以評價該方法的特異性.結果表明,針對北美H7N2禽流感和H7N8禽流感病毒HA質粒的擴增出現預期大小的PCR擴增條帶,其他毒株均未見擴增條帶.

2.3敏感性評價將北美H7亞型禽流感病毒A/ New York/107/2003(H7N2)HA質粒稀釋至10 ng/μL,再依次進行10倍倍比稀釋,作為模板進行RT-PCR擴增,評價該方法的敏感性.結果顯示,該引物能檢測出的最低質粒濃度為0.1 pg/μL.

圖1　北美H7亞型禽流感病毒HA基因RT-PCR檢測方法的特異性評價

圖2　北美H7亞型禽流感病毒HA基因RT-PCR檢測方法的敏感性評價

3　討論

歐洲、澳大利亞、加拿大、美國等歐美的國家是H7亞型禽流感疫情的高發(fā)地區(qū).近年來,巴基斯坦、朝鮮、韓國、日本等多個亞洲地區(qū)國家也開始頻繁出現H7亞型禽流感疫情[9-11].2013年暴發(fā)H7N9禽流感疫情之前,我國只在2002年河北省一蛋雞場分離到一株低致病性H7N2亞型禽流感病毒(A/Chicken/ Hebei/1/2002)[12].但隨著國際貿易的增加以及候鳥遷徙帶毒的影響,北美源H7亞型禽流感病毒傳染我國的風險日益增加,因此急需建立一種針對北美H7亞型禽流感病毒的快速檢測方法.

傳統(tǒng)的流感病毒檢測方法為將病料處理后,采用雞胚接種方式進行病毒分離,然后采用血凝抑制試驗對流感病毒亞型進行鑒定.但是這種傳統(tǒng)的檢測方法耗時較長,不能在短時間內確診.目前常用的檢測方法還有瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光技術等,但都存在費時、費力、繁瑣、花費大、靈敏度不高等不足[13].上述方法不適用于外來疫病的檢測.

聚合酶鏈式反應(PCR)是近年發(fā)展成熟的一種基因體外復制擴增技術,能使微量DNA在數小時內呈指數增加,具有特異性強、靈敏度高、簡便快捷等優(yōu)點[14].因此,可以利用目的基因質粒建立檢測方法,適用于外來疫病的監(jiān)測.本研究通過比對NCBI數據庫中的H7亞型禽流感病毒HA基因序列,建立了針對北美H7亞型禽流感HA基因的RT-PCR檢測方法.該方法能夠特異的檢測北美H7亞型禽流感病毒,而對歐亞譜系H1N1、H3N2、H5N1、H5N8、H7N2、H7N9和H9N2亞型流感病毒,以及其他主要禽呼吸道RNA病毒(新城疫和傳染性支氣管炎病毒)RT-PCR檢測結果均為陰性,表明該方法具有良好的特異性.該方法能檢測出的最低質粒濃度為0.1 pg/μL,具有良好的敏感性.Spackman等人建立了針對北美H7亞型HA基因的實時熒光RT-PCR檢測方法,其最低檢出量與本研究相似,均為0.1 pg/μL[15].在我國,目前尚無關于北美H7亞型禽流感病毒檢測方法的報道.因此,比較而言,本方法更經濟適用.

因此,本文所建立的針對北美H7亞型流感病毒的檢測方法特異性強、敏感性高、經濟實用,可以作為檢測北美H7亞型禽流感病毒外來疫病的監(jiān)測方法,對防止其入境傳播具有重要意義.

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RT-PCR assay for detection of North American H7 subtypeavian influenza virus

WANG Chen-xi,ZHANG Xu-xiao,SUN Hong-lei,PU Juan
(College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

In this study,a pair of specific oligo nucleotide primer was designed based on HA sequences available from NCBI database,and RT-PCR assay was established for the detection of North American H7 subtype AIV.The amplification by the RTPCR assay was positive for North American H7 AIVs but negative for Eurasian H7 subtype AIV(H7N2 and H7N9),other subtypes (H1N1,H3N2,H5N1,H5N8 and H9N2)of influenza viruses,Newcastle disease virus(NDV)and infectious bronchitis virus (IBV).The sensitivity was 0.1 pg/uL.This assay will provide a useful detection method for North American H7 subtype AIV in the surveillance of exotic diseases.

North American H7 subtype avian influenza virus;HA;RT-PCR

PU Juan

S852.65+5

A

0529-6005(2016)06-0028-03

2014-12-26

"十二五"國家科技支撐項目(2013BAD12B01)

王晨曦(1991-),女,碩士生,從事流感病毒研究工作,E-mail:wangchenxi911101@163.com

蒲娟,E-mail:pujuan@cau.edu.cn