王　勇　韓建文　白云花　孫志強(qiáng)　阿拉騰楚魯　劉　佳　李東霞　呂新翔　烏日娜

·短篇論著·

內(nèi)蒙古漢族尋常型銀屑病REL基因多態(tài)位點(diǎn)檢測

王勇1韓建文2白云花3孫志強(qiáng)2阿拉騰楚魯2劉佳2李東霞2呂新翔2烏日娜2

目的： 檢測內(nèi)蒙古漢族人尋常型銀屑?。≒sV）患者禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒癌基因V-Rel同源基因（REL）的多態(tài)性。方法： 提取301例PsV患者及292名正常對照外周血DNA，利用連接酶檢測反應(yīng)檢測REL基因區(qū)域的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）（rs702873、rs 842636、rs13031237和rs13017599）。結(jié)果： PsV患者rs702873和rs842636的等位基因頻率分別為0.126和0.128，對照組中分別為0.182和0.181，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）且rs702873和rs 842636間存在強(qiáng)連鎖不平衡（D'= 0.993，r2=0.980）。rs13031237和rs13017599等位基因頻率在PsV患者和對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論： REL基因位點(diǎn)（rs702873和rs 842636）多態(tài)性可能與內(nèi)蒙古漢族人PsV的易感性相關(guān)。

尋常型銀屑病? 單核苷酸多態(tài)性

銀屑病是常見的紅斑鱗屑性皮膚病。遺傳、免疫在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用。近年來的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了一批銀屑病易感基因，特別是核因子κB（NF-κB）病理通路中的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒癌基因V-Rel同源基因（REL）與尋常型銀屑?。≒sV）、銀屑病性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性在歐洲人群中已有報(bào)道［1-3］。并且REL基因與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也有相關(guān)性［3］。但目前尚無漢族人銀屑病與REL基因多態(tài)性的相關(guān)研究。本研究選擇則位于REL基因區(qū)域的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），利用連接酶檢測反應(yīng)（ligase detection reaction，LDR）對其進(jìn)行基因分型，探討其與漢族人PsV的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1資料

1.1.1研究對象 從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集漢族PsV患者301例，平均年齡（47.00±16.77）歲，平均發(fā)病年齡（33.48±15.48）歲?男女比例：1.76∶1，正常漢族對照292名，平均年齡（35.90±14.65）歲?男女比例：1.12∶1。經(jīng)知情同意并簽字后抽取外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，置于-80度冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者?jīng)臨床及病理證實(shí)，符合PsV診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有對照排除銀屑病及其他自身免疫疾病，排除銀屑病家族史。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，并在實(shí)施過程中遵守赫爾辛基宣言。

1.1.2SNPs選擇根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道，在REL基因區(qū)域選擇4個(gè)在歐洲人群中報(bào)道的銀屑病相關(guān)的SNP（rs702873、rs842636、rs13031237和rs13017599）［1-3］。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 利用基因組DNA提取試劑盒（康寧生命科學(xué)有限公司，中國蘇州）提取患者及對照基因組DNA，利用分光光度儀檢測260 nm和 280 nm吸光度，計(jì)算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，所有DNA樣本均合格。

1.2.2引物及探針的合成利用Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件（http：//frodo.wi.mit.edu/）和Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.，USA）軟件設(shè)計(jì)特異性引物和LDR探針，針對每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條引物，要盡量保證所有SNP位點(diǎn)的引物的T值相同，PCR反應(yīng)引物序列見表1。根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)LDR的上下游探針［4］，上游探針5'端用磷酸化修，LDR反應(yīng)探針序列見表2。

表1　PCR反應(yīng)引物序列

表2　LDR反應(yīng)探針序列

1.2.3多重PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系為（20μL） 1 μL模板，2μL Buffer緩沖液，0.6μL Mg2+，2μL dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，2μL引物混合液，加水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min?94℃30 s。56℃退火1.5 min。65℃30s，35個(gè)循環(huán)。最后65℃延伸10 min。

1.2.4多重LDR反應(yīng) LDR反應(yīng)體系為（10μL） 1 μL Buffer緩沖液，1μL探針混合液，0.05μL Taq DNA連接酶，4μL PCR產(chǎn)物，加水補(bǔ)足10μL。探針混合液濃度為2 pmol/μL。LDR反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性，94℃15 s，50℃25 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.5測序與基因分型反應(yīng)產(chǎn)物 經(jīng)過ABI3730測序儀測序分析，最后用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判讀各位點(diǎn)上各樣本的基因分型。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有SNP分型數(shù)據(jù)質(zhì)控、統(tǒng)計(jì)分析利用PLINK 1.07軟件完成。（http：//pngu.mgh. harvard.edu/purcell/plink/）［5］。計(jì)算4個(gè)SNP的等位基因頻率，病例組及對照中分別進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)?？ǚ綑z驗(yàn)（χ2）比較病例組及對照組等位基因頻率及基因型頻率，并計(jì)算等位基因的相對危險(xiǎn)度估計(jì)值比值比OR及其95%可信區(qū)間（95%CI）。對4個(gè)SNP間進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，計(jì)算兩兩間的r2和D'值。根據(jù)患者發(fā)病年齡（早發(fā)型：發(fā)病年齡<40歲?晚發(fā)型：發(fā)病年齡≥40歲）進(jìn)行分層分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，根據(jù)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正原理，P<0.0125（0.05/4）為差異有顯著性。

2　結(jié)果

2.1樣本及SNP質(zhì)控病例及對照樣本在性別及年齡無顯著性差異，具有可比性（P>0.05）。4個(gè)SNP在病例及對照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P> 0.05）。

2.2等位基因頻率 比較2個(gè)SNP的等位基因頻率與對照組差異具有顯著性，達(dá)到Bonferroni校正水平（P<0.0125）（表3）。rs702873的等位基因A在PsV組的頻率為12.6%，對照組中頻率為18.2%（P= 0.0091，OR=0.65）。rs842636的等位基因A在PsV組的頻率為12.8%，對照組中頻率為18.1%（P= 0.0122，OR=0.66）。另外2個(gè)SNP（rs13031237和 rs13017599）的等位基因頻率在病例組和對照組中無差異（P>0.6）。rs702873和rs842636間存在強(qiáng)連鎖不平衡（D'=0.993，r2=0.980）。控制rs702873后，rs842636與PsV無相關(guān)性（Pconditional=0.72），同樣控制rs842636后，rs702873也沒有相關(guān)性（Pconditional=0.47）。

根據(jù)發(fā)病年齡分層分析結(jié)果顯示，僅在晚發(fā)型PsV組中，rs702873和rs842636的等位基因頻率與對照組的差異，但未能達(dá)到Bonferroni校正水平（P分別為0.0134和0.0207）。在早發(fā)型病例組無顯著性（P> 0.05）。rs13031237和rs13017599的等位基因頻率在分層分析中均無顯著性差異（P>0.55）。

表3　四個(gè)SNP與PsV相關(guān)性及根據(jù)發(fā)病年齡分層分析

2.3基因型分析及根據(jù)發(fā)病年齡分層結(jié)果 在不同遺傳模式下比較病例組和對照組間基因型頻率，發(fā)現(xiàn)rs702873在顯性遺傳模式下，基因型AA+AG在PsV組中頻率為0.239，對照組中頻率為0.336（P= 0.0099，OR=0.62，95%CI：0.43～0.89），隱形遺傳模式下無顯著性。在分層分析后，早發(fā)型和晚發(fā)型的基因型頻率差異無顯著性差異（P>0.0125）。在顯性模式下，PsV組和對照組間（P=0.0143）、晚發(fā)型與對照組間（P=0.0347）的差異顯著，但未能達(dá)到Bonferroni校正水平。rs842636、rs13031237和rs13017599的基因型分析及根據(jù)發(fā)病年齡分層分析中均無顯著性差異（P>0.0125）。

3　討論

REL基因位于2p16.1，編碼c-Rel蛋白是NF-κB通路中的一種泛素蛋白。參與調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)、自身免疫相關(guān)基因的表達(dá)［6］。

既往在歐洲人群中的多項(xiàng)研究報(bào)道了REL與銀屑病及銀屑病性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性［1-3］。本研究基于既往歐洲人群的研究對位于REL基因區(qū)域的4個(gè)SNP與PsV的相關(guān)性進(jìn)行研究，證實(shí)了REL基因多態(tài)性與漢族人具有相關(guān)性。2個(gè)相關(guān)的SNP（rs702873和rs842636）間存在強(qiáng)連鎖不平衡，提示2個(gè)SNP可能代表同一個(gè)關(guān)聯(lián)信號(hào)。既往研究發(fā)現(xiàn)NF -κB病理通路中的一些相關(guān)基因均與銀屑病具有相關(guān)性，例如核因子kB抑制蛋白α亞基（NFKB1A）［7］、人腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3）［8］以及TNFAIP3相互作用蛋白1（TNIP1）［8-10］。這些研究提示NF-κB病理通路在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。

但是本研究沒有發(fā)現(xiàn)rs13031237和rs13017599兩個(gè)SNP與銀屑病的相關(guān)性。查詢既往研究文獻(xiàn)，比較這兩個(gè)SNP在歐洲人群和漢族人群的等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)存在明顯差異。rs13031237的等位基因T和rs13017599的等位基因A在本研究中頻率很低（小于0.03），但是在歐洲人群中的等位基因常見變異（頻率大于0.29）［2，3］。這一發(fā)現(xiàn)提示可能存在遺傳異質(zhì)性。可能是由于漢族人和歐洲人群中這一區(qū)域遺傳變異的連鎖不平衡關(guān)系不同導(dǎo)致的。rs702873在顯性模式下與PsV的相關(guān)性最為顯著，提示這一遺傳變異呈顯性遺傳模式。在根據(jù)發(fā)病年齡分層分析結(jié)果顯示rs702873和rs842636與晚發(fā)型PsV具有相關(guān)性。這一結(jié)果提示這2個(gè)SNP可能與晚發(fā)型PsV的易感性相關(guān)，但是由于樣本量不夠大，未能達(dá)到Bonferroni校正水平，還需要更大樣本量的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這一假設(shè)。

本研究通過對REL基因區(qū)域4個(gè)SNP進(jìn)行分型研究（rs702873、rs842636、rs13031237和rs13017599），證實(shí)了其與漢族人PsV的相關(guān)性，REL基因可能是多個(gè)種族中銀屑病的共同易感基因，但不同種族間存在有遺傳異質(zhì)性。更進(jìn)一步提示REL基因在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。本研究仍存在一些不足之處：第一，由于樣本量有限，我們不能排除rs13031237和rs13017599與漢族人銀屑病的相關(guān)性，也不能除外rs702873和rs842636與早發(fā)型PsV的相關(guān)性?第二，本研究所分析的4個(gè)SNP均不是功能變異，仍需要進(jìn)一步的精細(xì)定位研究尋找導(dǎo)致影響銀屑病易感性的原因變異?第三，REL基因多態(tài)性如何影響其基因功能以及如何影響免疫系統(tǒng)功能，仍需要進(jìn)一步功能學(xué)研究。

［1］Strange A，Capon F，Spencer CC，et al.A genome-wide as sociation study identifies new psoriasis susceptibility loci and an interaction between HLA-C and ERAP1［J］.Nat Genet，2010，42（11）：985-990.

［2］Ellinghaus E，Stuart PE，Ellinghaus D，et al.Genome-wide meta-analysis of psoriatic arthritis identifies susceptibility locus at REL［J］.J Invest Dermatol，2012，132（4）：1133-1140.

［3］AliFR，Barton A，Smith RL，etal.An investigation of rheumatoid arthritis loci in patientswith early-onset psoriasis validates association of the REL gene［J］.Br JDermatol，2013，168（4）：864-866.

［4］Yi P，Chen Z，Yu L，et al.Development of a PCR/LDR/ capillary electrophoresis assay with potential for the detection of a beta-thalassemia fetalmutation inmaternal plasma［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2010，23（8）：920-927.

［5］Purcell S，Neale B，Todd-Brown K，etal.PLINK：a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses［J］.Am JHum Genet，2007，81（3）：559-575.

［6］Hayden MS，West AP，Ghosh S.NF-kappaB and the immune response［J］.Oncogene，2006，25（51）：6758-6780.

［7］Li Y，Cheng H，Zuo XB，et al.Association analyses identifying two common susceptibility loci shared by psoriasis and systemic lupus erythematosus in the Chinese Han population［J］.JMed Genet，2013，50（12）：812-818.

［8］Nair RP，Duffin KC，Helms C，et al.Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways［J］.Nat Genet，2009，41（2）：199-204.

［9］Sun LD，Cheng H，Wang ZX，et al.Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population［J］.Nat Genet，2010，42（11）：1005-1009.

［10］Yang Q，Liu H，Qu L，et al.Investigation of 20 non-HLA（human leucocyte antigen）psoriasis susceptibility loci in Chinese patientswith psoriatic arthritis and psoriasis vulgaris［J］.Br JDermatol，2013，168（5）：1060-1065.

（收稿：2015-09-14）

Detection of the polym orphism s of REL gene in the patients w ith psoriasis vulgaris in Han nationality of Inner Mongolia

WANG Yong1，HAN Jianwen2，BAIYunhua3，SUN Zhiqiang2，ALATENGChulu2，LIU Jia2，LIDongxia2，LV Xinxiang2，WU Rina2.
1.Department ofRheumatology，the Affiliated Hospital of InnerMongolia Medical University，Hohhot010050，China?2.Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China?3.Department of Dermatology，Hulunbeier People's Hospital，Hulunbeier021000，China

HAN Jianwen，E-mail：hanjianwen1981@hotmail.com

Objective：To detect the polymorphisms of REL（v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog）in Han nationality of Inner Mongolia.M ethods：DNA was extracted from the peripheral blood of 301 patients and 292 healthy controls.The polymorphisms of REL gene（rs702873，rs 842636，rs13031237 and rs13017599）were genotyped by PCR-based ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results：The genotype frequencies of rs702873 and rs 842636 in the patientswere 0.126 and 0.128 and those in controlswere 0.182 and 0.181，with significantdifference（P<0.05）.Therewas a linkage disequilibrium of rs702873 and rs 842636.There was no significant difference in rs13031237 and rs13017599 between the patients and controls（P>0.05）.Conclusion：The polymorphisms of REL gene（rs702873 and rs842636）are associated with psoriasis vulgaris in Han nationality of Inner Mongolia.

psoriasis vulgaris?single nucleotide polymorphisms

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160192）?內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（編號(hào)：NY2011QN005）?內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201303057）?

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計(jì)劃（編號(hào)：NJYT -14-B17）

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，呼和浩特，010050

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，呼和浩特，010050

3呼倫貝爾市人民醫(yī)院皮膚科，呼倫貝爾市，021000

韓建文，E-mail：hanjianwen1981@hotmail.com