吳隆超　王琳娜　劉瑞東　王曉麗　田文霞　李興濤　張俊

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TW-37調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制體外胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

吳隆超王琳娜劉瑞東王曉麗田文霞李興濤張俊

目的觀察TW-37干預(yù)對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及血管生成的影響，探討其可能機(jī)制。方法應(yīng)用TW-37干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株BxPC3和HPAC，以轉(zhuǎn)染NF-κB p65 cDNA(p65 cDNA)、靶向NF-κB p65的siRNA(siRNA-p65)細(xì)胞及未干預(yù)細(xì)胞作為對照組。采用MTT和ELISA法檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡；應(yīng)用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力；采用體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)成管實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清對血管生成的影響；ELISA法檢測細(xì)胞NF-κB活性；蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞NF-κB靶向調(diào)節(jié)蛋白VEGF、MMP-9表達(dá)。結(jié)果TW-37呈濃度和時(shí)間依賴性抑制BxPC3、HPAC細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)兩株細(xì)胞的凋亡(A405值1.29±0.21比0.09±0.01，1.07±0.18比0.08±0.01)，抑制細(xì)胞NF-κB活性及NF-κB p65、VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。對照組、0.75 μmol/L TW-37干預(yù)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(46.7±5.24)、(10.3±1.26)個(gè)/200倍視野；HUVECs形成的血管數(shù)分別為(39.4±4.36)、(7.84±1.25)個(gè)/200倍視野，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.001)。轉(zhuǎn)染p65 cDNA 的兩株細(xì)胞的NF-κB活性較對照組顯著增加，用TW-37干預(yù)后NF-κB活性下降；轉(zhuǎn)染siRNA-p65的兩株細(xì)胞的NF-κB活性較對照組顯著下降，用TW-37干預(yù)后NF-κB活性進(jìn)一步下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。轉(zhuǎn)染p65 cDNA對兩株細(xì)胞凋亡無明顯影響，用TW-37干預(yù)后凋亡略有變化；轉(zhuǎn)染siRNA-p65的兩株細(xì)胞凋亡顯著增加，用TW-37干預(yù)后又進(jìn)一步增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。結(jié)論TW-37通過NF-κB抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

胰腺腫瘤；生長；腫瘤轉(zhuǎn)移；病理性血管生成；TW-37

μmol/L TW-37 group (P=0.001). The number of tube formation was (39.4±4.36) and (7.84±1.25)/×200, (P=0.001). NF-κB activity was increased by p65 cDNA transfection, and decreased by TW-37 treatment in both of the two cell lines (P<0.05). However, NF-κB activity was decreased by p65 siRNA transfection, and greatly decreased by TW-37 treatment in both two cell lines (P<0.05 orP<0.01). Transfection of p65 cDNA did not significantly affect cell apoptosis. Transfection of p65 siRNA increased cell apoptosis, and greatly increased by TW-37 treatment in both two cell lines (allP<0.01). ConclusionsTW-37 could inhibit the proliferation, invasion and angiogenesis in pancreatic cancer cells by regulating NF-κB signal pathway.

胰腺癌是極易侵襲和轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療手段療效差，因此基因治療胰腺癌是目前研究的熱點(diǎn)[1]。Bcl-2在胰腺癌組織過度表達(dá)，激活NF-κB，發(fā)揮抗凋亡和促胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用[2-3]。文獻(xiàn)報(bào)道[4]，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制胰腺癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的生長和侵襲能力，提示Bcl-2可能是胰腺癌基因治療的有效靶點(diǎn)。TW-37是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl-2的小分子抑制劑，它對多種腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移都有明顯的抑制作用[5]。本研究觀察TW-37對胰腺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和血管生成的影響，探討TW-37的作用機(jī)制。

材料與方法

一、蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞Bcl-2、NF-κBp65、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)

胰腺癌AsPC1、BxPC3、HPAC和PANC1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞研究所。收集各組細(xì)胞，使用Epigentek公司的蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白并分離核蛋白，按照試劑盒說明書操作。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞Bcl-2、NF-κB p65(p65)、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。鼠抗人p65、Bcl-2 、MMP-9、VEGF一抗工作濃度分別為1∶200、1∶150、1∶200、1∶200，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG工作濃度1∶5 000。應(yīng)用北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司 ChampGelTM3-4軟件進(jìn)行圖像定量分析。

二、電泳遷移率改變分析(EMSA)法檢測NF-κB活性

取siRNA-p65、p65 cDNA轉(zhuǎn)染24 h后的BxPC3細(xì)胞，再應(yīng)用0.25、0.75 μmol/L TW-37(上海賽鑫生物科技有限公司)干預(yù)48 h，同時(shí)設(shè)單純轉(zhuǎn)染組、單純TW-37干預(yù)組及未轉(zhuǎn)染未干預(yù)的對照組。用預(yù)冷的PBS(pH7.2)反復(fù)沖洗以收集細(xì)胞，常規(guī)離心后再用PBS洗1次。加緩沖液A 100 μl重懸細(xì)胞，置冰浴15 min，再加10% NP 40 μl，渦動(dòng)10 s，4℃ 3 000 g離心5 min，取上清液(胞質(zhì)提取物)，移至新試管，分別加pH7.9的HEPEs(10 mmol/L)及終濃度為40、150 μmol/L的KCl，冰浴孵育30 min，13 000 g離心30 min。收集上清液(胞質(zhì)蛋白)，Lowery法定量蛋白后置-80℃?zhèn)溆?。沉淀用低滲緩沖液洗后重懸于適量低鹽緩沖液中，然后逐滴加入等量高滲緩沖液，4℃孵育30 min，間歇震蕩，最后4℃ 13 000 g離心30 min，收集上清液(核蛋白)，Lowery法定量蛋白后置-80℃?zhèn)溆?。探針NF-κB寡核苷酸序列為5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′及5′-GCCTGGGAAATCCCCTCAACT-3′，由生工生物工程有限公司合成，應(yīng)用T4多聚核酸酶(Roche Applied Science公司)將4 μl γ-[32P]-ATP(上海嵐派生物科技有限公司)標(biāo)記到雙鏈寡核苷酸上，按說明書操作。每個(gè)反應(yīng)體系含Nuclease-Free Water 5 μl，EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2 μl，細(xì)胞核蛋白2 μl，l μl標(biāo)記的寡核苷酸探針，混合后經(jīng)含40%甘油的凝膠電泳分離，然后壓片，置-70℃曝光12 h后顯影。以不加細(xì)胞核蛋白作為對照組。

三、ELISA法檢測p65蛋白的結(jié)合活性

取親和素包被的96孔ELISA板，加33 nmol/L生物素化dsDNA(含NF-κB p65亞基結(jié)合的共有序列)，室溫孵1 h。洗滌后用含3%脫脂牛奶的轉(zhuǎn)錄因子緩沖液封閉1 h，洗滌后每孔分別加50 μl各組核蛋白提取液,室溫下孵育1 h，洗滌后加入兔抗人NF-κB抗體，室溫下孵育1 h，洗滌后加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(BD Transduction Labs)，室溫下孵育30 min，洗滌后加100 μl TMB顯色，上酶標(biāo)儀檢測各孔在波長450 nm的吸光度值(A450值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NF-κB亞單位p65的結(jié)合活性。

四、MTT 法檢測細(xì)胞增殖

AsPC1、BxPC3、HPAC和PANC1細(xì)胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基+10%滅活小牛血清常規(guī)傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后每孔分別加入0.25、0.5、0.75 μmol/L TW-37繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，以無血清DMEM代替TW-37作為對照組。培養(yǎng)到時(shí)間點(diǎn)后加入0.5 mg/ml MTT 20 μl (Sigma公司)繼續(xù)孵育2 h，離心棄上清，加入DMS 0.2 ml，吹打后上酶標(biāo)儀測各孔570 nm處的吸光度值(A570值)。每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。繪制細(xì)胞生長曲線。

五、ELISA法檢測細(xì)胞凋亡

取上述各組對數(shù)生長期細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，取上清(細(xì)胞釋放的單/低聚核小體片段)20 μl加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中，另加入80 μl免疫反應(yīng)試劑(抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液以1∶1∶18混合)，室溫置搖床上(250 r/min) 孵育2 h，棄上清，用300 μl溫育緩沖液洗滌3次后加入100 μl底物緩沖液，室溫置搖床上孵育10～20 min，呈現(xiàn)適中的黃色時(shí)上酶標(biāo)儀檢測各孔在波長405 nm的吸光度值(A405值)，參考波長492 nm。

六、Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力

用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel，取60 μl稀釋的Matrigel鋪在Transwell小室的隔膜上待其凝固。取上述各組細(xì)胞，用無FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后重懸于無FBS的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。Transwell上室加200 μl細(xì)胞懸液，下室加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μl，小室置37℃、5% CO2孵育48 h。取出隔膜，用棉簽輕輕擦去未穿膜細(xì)胞后用丙酮固定，0.1%結(jié)晶紫染色。于顯微鏡下取5個(gè)200倍視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞用3個(gè)小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

七、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)成管實(shí)驗(yàn)

人臍靜脈上皮細(xì)胞株HUVECs購自ATCC，常規(guī)培養(yǎng)于F12K介質(zhì)。應(yīng)用0.75 μmol/L TW-37干預(yù)BxPC3 細(xì)胞24 h，收集培養(yǎng)液，離心并轉(zhuǎn)移于新鮮的試管，置-20℃保存。取對數(shù)生長期HUVECs細(xì)胞 ，以5×104個(gè)細(xì)胞接種于16孔培養(yǎng)板，每孔加上述離心液10 μl，培養(yǎng)6 h。顯微鏡下取3～5個(gè)200倍視野，利用Imagel軟件分析血管數(shù)目。

八、質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

靶向p65的siRNA(siRNA-p65，No：sc-29410)及陰性對照siRNA(siRNA-NC)均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。委托北京輝駿生物公司將各siRNA插入pcDNA.3.1，并經(jīng)測序證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。插入p65 cDNA的質(zhì)粒pcDNA.3.1 p65 cDNA由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科何忠義博士惠贈。

BxPC3 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)并傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，加入無抗生素培養(yǎng)基2 ml，待細(xì)胞生長至40%～60%融合時(shí)應(yīng)用Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑盒將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照說明書操作。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞按上述方法進(jìn)行NF-κB活性及細(xì)胞凋亡的檢測。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、不同胰腺癌細(xì)胞株Bcl-2、NF-κB表達(dá)水平

胰腺癌BxPC3細(xì)胞Bcl-2蛋白高表達(dá)，其次為HPAC細(xì)胞，AsPC1細(xì)胞表達(dá)較少，PANC1細(xì)胞表達(dá)極少； NF-κB蛋白表達(dá)量從高到低依次為PANC1、HPAC、BxPC3、AsPC1細(xì)胞(圖1)。由于BxPC3和HPAC細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量較高，因此以BxPC3和HPAC細(xì)胞作為研究對象。

圖1　AsPC1(1)、BxPC3(2)、HPAC(3)、PANC1(4)細(xì)胞Bcl-2及NF-κB表達(dá)

二、TW-37干預(yù)對BxPC3、HPAC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

TW-37干預(yù)后，BxPC3和HPAC細(xì)胞的增殖呈濃度和時(shí)間依賴性下降(P<0.05或<0.01，圖2)。0.25、0.5、0.75 μmol/L TW-37干預(yù)72 h，BxPC3細(xì)胞凋亡的A405值分別為0.43±0.06、0.76±0.13、1.29±0.21，顯著高于未干預(yù)細(xì)胞的0.09±0.01； HPAC細(xì)胞凋亡的A405值分別為0.38±0.07、0.64±0.12、1.07±0.18，顯著高于未干預(yù)細(xì)胞的0.08±0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。

圖2　不同濃度TW-37對BxPC3(2A)、HPAC細(xì)胞(2B)增殖的影響

三、TW-37干預(yù)對BxPC3、HPAC細(xì)胞NF-κB活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

TW-37以時(shí)間和劑量依賴性抑制BxPC3、HPAC細(xì)胞NF-κB的活性；呈濃度依賴性抑制BxPC3、HPAC細(xì)胞p65及VEGF和MMP-9蛋白的表達(dá)(P值均<0.05，圖3)。

四、TW-37 干預(yù)對轉(zhuǎn)染的BxPC3細(xì)胞侵襲能力的影響

對照組及0.25、0.75 μmol/L TW-37干預(yù)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(46.7±5.24)、(24.7±3.8)、(10.3±1.26)個(gè)/200倍視野，細(xì)胞的侵襲能力隨TW-37濃度的增加而下降(圖4)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.74，P=0.001)。

五、TW-37干預(yù)對HUVECs血管形成的影響

對照組、0.75 μmol/L TW-37干預(yù)24 h組的培養(yǎng)上清加入HUVECs培養(yǎng)液中所形成的血管數(shù)分別為(39.4±4.36)、(7.84±1.25)個(gè)/200倍視野，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.257，P=0.001，圖5)。

圖3　TW-37干預(yù)后BxPC3、HPAC細(xì)胞NF-κB(3A、3B)及p65、MMP-9、VEGF(3C、3D)的表達(dá)

圖4　對照組(4A)及0.25、0.75 μmol/L TW-37干預(yù)組(4B、4C)穿膜細(xì)胞(×200)

圖5　對照組(5A)、0.75Tμmol/L TW-37干預(yù)組(5B)HUVECs血管形成(×200)

六、TW-37干預(yù)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞NF-κB活性及細(xì)胞凋亡的影響(表1)

單純TW-37干預(yù)的BxPC3和HPAC細(xì)胞的NF-κB活性較對照組顯著下降；轉(zhuǎn)染p65 cDNA 的兩株細(xì)胞的NF-κB活性較對照組顯著增加；p65 cDNA轉(zhuǎn)染后再用TW-37干預(yù)的兩株細(xì)胞的NF-κB活性較單轉(zhuǎn)染p65 cDNA組細(xì)胞下降；轉(zhuǎn)染siRNA-p65的兩組細(xì)胞的NF-κB活性較對照組下降，siRNA-p65轉(zhuǎn)染后用TW-37干預(yù)的兩組細(xì)胞的NF-κB活性又較單siRNA-p65轉(zhuǎn)染組細(xì)胞進(jìn)一步下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05或<0.01)。

單純TW-37干預(yù)可誘導(dǎo)BxPC3和HPAC細(xì)胞凋亡，與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單純p65 cDNA轉(zhuǎn)染對兩組細(xì)胞凋亡無明顯影響，但p65 cDNA轉(zhuǎn)染后再用TW-37干預(yù)的BxPC3細(xì)胞較單p65 cDNA轉(zhuǎn)染增加，而HPAC細(xì)胞凋亡是減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染siRNA-p65的兩組細(xì)胞凋亡顯著增加，轉(zhuǎn)染siRNA-p65后再用TW-37干預(yù)的兩組細(xì)胞凋亡又較單siRNA-p65轉(zhuǎn)染組細(xì)胞顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

表1　各組BxPC3、HPAC細(xì)胞的NF-κB活性及細(xì)胞凋亡的變化

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與siRNA-p65轉(zhuǎn)染組比較，cP<0.05

討　　論

Bcl-2通路在包括胰腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[5]。激活Bcl-2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長并抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)可提高細(xì)胞的侵襲能力[6]。Garcea等[2]報(bào)道，過度表達(dá)Bcl-2的胰腺癌患者的生存率明顯下降，因此靶向Bcl-2的治療很可能成為胰腺癌治療的有效方式。TW-37是最近發(fā)現(xiàn)的小分子的Bcl-2表達(dá)抑制物，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)它能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞生長[7-9]。

NF-κB p65是腫瘤治療的重要靶向基因，激活NF-κB能調(diào)節(jié)VEGF和MMP-9等多個(gè)下游基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移[10]。

此外，Bcl-2與NF-κB均參與細(xì)胞生長和凋亡的調(diào)節(jié)。抑制Bcl-2表達(dá)能抑制胰腺癌細(xì)胞內(nèi)NF-κB 活性，表明NF-κB可能是Bcl-2的靶點(diǎn)[11]。

本研究結(jié)果顯示，BxPC3、HPAC細(xì)胞有不同程度的Bcl-2基因表達(dá)，均過表達(dá)NF-κB。TW-37干預(yù)后不僅能抑制癌細(xì)胞的增殖，還能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，與Azmi等[12]在前列腺癌的研究結(jié)果相一致。結(jié)果還顯示，TW-37干預(yù)能抑制癌細(xì)胞NF-κB活化，且對轉(zhuǎn)染siRNA-p65細(xì)胞的NF-κB活性抑制作用更顯著，而細(xì)胞凋亡增加，提示TW-37可能通過抑制NF-κB活性、NF-κB p65及Bcl-2表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果同時(shí)還顯示， TW-37干預(yù)能抑制體外胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力，減少 HUVECs的血管形成，提示TW-37可能是治療胰腺癌的有效分子。

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(本文編輯：呂芳萍)

TW-37 inhibited metastasis in pancreatic cancer via regulating NF-κB signal in vitro

WuLongchao,WangLinna,LiuRuidong,WangXiaoli,TianWenxia,LiXingtao,ZhangJun.

DepartnentofGeneralSurgery,People′sHospitalofPenglai,Penglai265600,China

Correspondingauthor:ZhangJun,Email:yanxiangnj@126.com

ObjectiveTo study the effect and mechanisms of TW-37 on cell proliferation, apoptosis, invasion and angiogenesis in pancreatic cancer cells in vitro and further explore the potential mechanism. MethodsBxPC3 and HPAC cells were pretreated with TW-37 using untransfected or transfected with NF-κB p65 cDNA(p65 cDNA)or NF-κB p65 siRNA(siRNA-p65)cells as controls. Cell viability was determined by MTT assay. Cell apoptosis was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Cell invasion and angiogenesis was detected by Transwell and endothelial tube formation assay of HUVECs. ELISA assay was used to measure the activity of NF-κB, and its target proteins of MMP-9 and VEGF were detected by western blot. ResultsTW-37 suppressed cell growth and induced apoptosis (A405:1.29±0.21vs0.09±0.01，1.07±0.18vs0.08±0.01),inhibited NF-κB activity and protein expression of NF-κB p65, VEGF and MMP-9(allP<0.05)in a dose- and time-dependent manner. The number of cells that invaded across the matrigel in the transwell chamber was (46.7±5.24) and (10.3±1.26)/×200 in BxPC3 control and 0.75

Pancreatic neoplasms;Growth;Neoplasm metastasis;Neovascularization, pathologic;TW-37

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.006

265600山東蓬萊，蓬萊市人民醫(yī)院普外科(吳隆超)；山東省青島療養(yǎng)院檢驗(yàn)科(王琳娜)；萊蕪市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(劉瑞東、王曉麗、田文霞、李興濤)；浙江省人民醫(yī)院腫瘤外科(張俊)

張俊，Email: yanxiangnj@126.com

2015-07-20)