孫運(yùn)良　虞陽　童依麗　吳洪玉　馬建霞

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Toll樣受體4與胰腺癌PANC1細(xì)胞對吉西他濱敏感性的關(guān)系

孫運(yùn)良虞陽童依麗吳洪玉馬建霞

目的觀察Toll樣受體4(TLR4)與胰腺癌PANC1細(xì)胞對吉西他濱(GEM)敏感性的關(guān)系，探討其相關(guān)機(jī)制。 方法將PANC1細(xì)胞分為GEM組、脂多糖(LPS)+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組。GEM組給予GEM處理，LPS+GEM組先用1 mg/L的LPS干預(yù)4 h后再用GEM處理，TLR4-siRNA+GEM組先用100 pmol/ml TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h后再用GEM處理。以不做任何處理的細(xì)胞作為對照組。采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞TLR4、磷酸化AKT(p-AKT)、活性Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組GEM對PANC1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(8.90±0.62)、(14.21±0.95)、(3.96±0.27)mg/L，LPS+GEM組顯著高于GEM組，TLR4-siRNA+GEM組顯著低于GEM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。LPS+GEM組典型凋亡形態(tài)學(xué)改變的細(xì)胞數(shù)較GEM組減少，而TLR4-siRNA+GEM組則較GEM組增多；對照組、GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細(xì)胞凋亡率分別為(2.1±0.3)%、(15.1±2.3)%、(9.8±1.5)%、(22.9±3.1)%，LPS+GEM組顯著低于GEM組，TLR4-siRNA+GEM組顯著高于GEM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。4組的TLR4表達(dá)量分別為0.83±0.08、0.81±0.07、0.85±0.07、0.16±0.03；p-AKT表達(dá)量為0.61±0.05、0.36±0.03、0.73±0.07、0.21±0.02；活性Caspase-3表達(dá)量為0.66±0.05、0.73±0.07、0.45±0.04、0.91±0.07。TLR4-siRNA+GEM組的TLR4、p-AKT表達(dá)均較GEM組顯著下降(P值均<0.01)，而活性Caspase-3表達(dá)顯著增高(P<0.05)。LPS+GEM組的p-AKT表達(dá)較GEM組顯著增加(P<0.01)，而活性Caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)。結(jié)論TLR4可抑制胰腺癌PNAC1細(xì)胞對GEM的敏感性，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT通路，下調(diào)活性Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

胰腺腫瘤；Toll樣受體4；抗藥性，腫瘤；吉西他濱；磷酸化AKT；活性Caspase-3

Fund program：Excellent Youth Physicians of Shanghai HuaDong Hospital(HDGG2014003)；Scientific Research Project of Lianyungang Municipal Planning Commission(1427)

吉西他濱(gemcitabine，GEM)是目前治療中晚期胰腺癌的一線化療藥物，但胰腺癌是耐藥性很強(qiáng)的腫瘤，GEM單藥治療對延長胰腺癌患者生存期的效果并不令人滿意[1-3]，因此從分子水平上研究胰腺癌化療耐藥的相關(guān)機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，以期提高胰腺癌的化療敏感性受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)已被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。近年來的研究還表明，TLR4的異常表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥[6-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TLR4在胰腺癌呈高表達(dá)，且與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。但有關(guān)TLR4是否參與胰腺癌對吉西他濱化療耐藥的研究較少。本研究通過TLR4的配體脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)干預(yù)及采用特異性siRNA沉默TLR4基因表達(dá)的方法觀察胰腺癌PANC1細(xì)胞對GEM敏感性的變化，并探討相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購自美國ATCC公司。GEM為法國Llilly公司產(chǎn)品，PBS稀釋后備用。LPS為Sigma公司產(chǎn)品。靶向TLR4的siRNA(TLR4-siRNA)正義序列5′-CUUUAUCCAACCAGGUGCAUUUU-3′，反義序列5′-AAUGCACCUGGUUGGAUAAAGUU-3′，由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成。Hoechst 33258、AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司。磷酸化AKT(p-AKT)單抗為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，抗TLR4、活性Caspase-3(經(jīng)過系列反應(yīng)被激活的Caspase為活性Caspase)多抗購自Santa Cruz公司。

二、方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)及TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染：PANC1細(xì)胞置含有10% FBS、青霉素及鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養(yǎng)液中在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞加入6孔板，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁。將100 pmol TLR4-siRNA加入到100 μl的無血清DMEM培養(yǎng)液混勻，用100 μl無血清DMEM加5 μl lipofectamin2000輕輕混勻后室溫放置5 min，將稀釋好的TLR4-siRNA、lipofectamin2000試劑輕柔混勻后室溫放置20 min以形成TLR4-siRNA/lipofectamin復(fù)合物。棄去6孔板各孔培養(yǎng)液，加入200 μl TLR4-siRNA/lipofectamin復(fù)合物和800 μl無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h以獲取轉(zhuǎn)染TLR4-siRNA的PANC1細(xì)胞。

2．MTT法檢測細(xì)胞增殖：收集對數(shù)生長期PANC1細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞加入96孔板。待細(xì)胞貼壁后更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組，每組6個(gè)復(fù)孔。GEM組分別加入終濃度為0.01、0.1、1、10 mg/L的GEM；LPS+GEM組先用1 mg/L的LPS干預(yù)細(xì)胞4 h，棄去培養(yǎng)液，再分別加入上述不同濃度的GEM； TLR4-siRNA+GEM組先用100 pmol/ml的TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h，棄去培養(yǎng)液，再分別加入上述不同濃度的GEM。以不做任何處理的PANC1細(xì)胞作為對照組。各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，上酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔在波長570 nm處的吸光度值(A570值)。細(xì)胞生長抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A570值/對照組A570值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3．Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化：取對數(shù)生長期PANC1細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后同樣分為上述3組，但GEM濃度只有1 mg/L，以不做任何處理的細(xì)胞作為對照組。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS沖洗細(xì)胞3次，加入Hoechst33258室溫避光染色10 min，置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

4．流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取上述培養(yǎng)24 h的4組細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。嚴(yán)格按Annexin V-FITC試劑盒說明書操作。

5．蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表達(dá)：取上述培養(yǎng)24 h的4組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用蛋白分析系統(tǒng)(Bio-Rad)測定蛋白濃度，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參?？筎LR4、p-AKT、Caspase-3抗體工作濃度1∶500，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗工作濃度1∶5 000，最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。應(yīng)用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)對膠片掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、各組PANC1細(xì)胞增殖的變化

隨著GEM濃度的增加，LPS+GEM組對PANC1細(xì)胞抑制率較GEM組顯著下降，而TLR4-siRNA+GEM組的抑制率較GEM組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01，圖1)。GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組GEM對PANC1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(8.90±0.62)、(14.21±0.95)、(3.96±0.27)mg/L，LPS+GEM組顯著高于GEM組，TLR4-siRNA+GEM組顯著低于GEM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.438，P<0.01；t=17.927，P<0.01)。

圖1　GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組PANC1細(xì)胞的生長抑制率曲線

二、各組PANC1細(xì)胞凋亡的變化

熒光顯微鏡下對照組細(xì)胞未見明顯凋亡的形態(tài)學(xué)改變；GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞核濃縮以及凋亡小體形成等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。LPS+GEM組典型凋亡形態(tài)學(xué)改變的細(xì)胞數(shù)較GEM組減少，而TLR4-siRNA+GEM組則較GEM組增多(圖2)；對照組、GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細(xì)胞凋亡率分別為(2.1±0.3)%、(15.1±2.3)%、(9.8±1.5)%、(22.9±3.1)%。LPS+GEM組細(xì)胞凋亡率較GEM組顯著減少，而TLR4-siRNA+GEM組較GEM組顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.384，P<0.05；t=4.451，P<0.01，圖3)。

圖2　對照組(2A)、GEM組(2B)、LPS+GEM組(2C)、TLR4-siRNA+GEM組(2D)PANC1細(xì)胞的形態(tài)變化(熒光顯微鏡　×200)

圖3　對照組(3A)、GEM組(3B)、LPS+GEM組(3C)、TLR4-siRNA+GEM組(3D)PANC1細(xì)胞的凋亡

三、各組PANC1細(xì)胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表達(dá)的變化

對照組、GEM組、LPS+GEM組、TLR4-siRNA+GEM組細(xì)胞TLR4表達(dá)量分別為0.83±0.08、0.81±0.07、0.85±0.07、0.16±0.03；p-AKT表達(dá)量為0.61±0.05、0.36±0.03、0.73±0.07、0.21±0.02；活性Caspase-3表達(dá)量為0.66±0.05、0.73±0.07、0.45±0.04、0.91±0.07(圖4)。TLR4-siRNA+GEM組的TLR4、p-AKT蛋白表達(dá)均較GEM組顯著下降，活性Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增高(t=16.304，P<0.01；t=7.273，P<0.05；t=2.935，P<0.01)； LPS+GEM組p-AKT蛋白表達(dá)較GEM組顯著增加，活性Caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少(t=8.748，P<0.01；t=5.852，P<0.01)，而TLR4蛋白表達(dá)與GEM組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討　　論

TLRs是Toll基因所編碼的一類跨膜受體蛋白，其中TLR4是目前研究相對較為成熟的TLR家族成員。在TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，LPS是TLR4的配體，它可識別并結(jié)合TLR4，進(jìn)而產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)宿主發(fā)生免疫防御反應(yīng)。目前的研究證實(shí)，TLR4除了在免疫細(xì)胞表達(dá)外，還在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，與結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Wang等[4]報(bào)道，TLR4在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且LPS能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HL-7702、PLC/PRF/5的增殖。Hsu等[5]報(bào)道，TLR4在結(jié)腸癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖4　對照組(1)、GEM組(2)、LPS+GEM組(3)、TLR4-siRNA+GEM組(4)PANC1細(xì)胞TLR4、p-AKT、活性Caspase-3蛋白表達(dá)

近年來，越來越多的的證據(jù)表明，TLR4的異常表達(dá)除了與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，還參與多種腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥作用。Zhang等[6]報(bào)道，通過LPS激活TLR4表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞PC-3對多西他賽的化療敏感性明顯下降；而通過siRNA干擾下調(diào)TLR4表達(dá)后，PC-3細(xì)胞對多西他賽的化療敏感性顯著增高。Sun等[7]的研究結(jié)果表明，TLR4在人口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)的TLR4與口腔鱗狀細(xì)胞癌對順鉑的化療耐藥有關(guān)。此外有研究證實(shí)，紫杉醇也是TLR4的重要配體，它可通過激活TLR4信號通路，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子及抗凋亡分子表達(dá)增加，從而降低腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的化療敏感性[8]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS激活TLR4后，GEM對PANC1細(xì)胞的IC50顯著升高，而凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率顯著下降；應(yīng)用TLR4-siRNA沉默TLR4表達(dá)后，GEM對PANC1細(xì)胞的IC50顯著降低，而凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率顯著增加，同樣表明TLR4可抑制胰腺癌細(xì)胞對GEM的敏感性。

PI3K/AKT通路廣泛存在于各種細(xì)胞，是參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。AKT是PI3K下游直接的靶蛋白，具有絲氨酸/蘇氨酸殘基，可直接被PI3K激活；p-AKT是AKT的功能活化狀態(tài)。目前已證實(shí)，PI3K/AKT通路在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈持續(xù)激活狀態(tài)，持續(xù)激活的PI3K/AKT通路可誘導(dǎo)VEGF以及IL-8等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展。經(jīng)LPS激活TLR4蛋白后可促進(jìn)AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長；而使用RNA干擾技術(shù)沉默TLR4基因表達(dá)后可抑制PI3K/AKT通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[10-12]。本研究結(jié)果顯示，LPS+GEM組胰腺癌PANC1細(xì)胞p-AKT的表達(dá)較GEM組顯著增加，而TLR4-siRNA+GEM組在抑制TLR4表達(dá)的同時(shí)導(dǎo)致p-AKT表達(dá)較GEM組顯著減少，提示TLR4具有激活胰腺癌細(xì)胞PI3K/AKT通路的作用。

Caspase是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，通常以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞胞質(zhì)中，經(jīng)過系列反應(yīng)被激活后可參與切割細(xì)胞內(nèi)多種底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡?；罨腃aspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子。研究顯示，抑制Caspase-3活化是PI3K/AKT促腫瘤的重要機(jī)制；阻斷PI3K/AKT通路可上調(diào)活性Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的[13]。本研究結(jié)果顯示，與GEM組相比，LPS+GEM組活性Caspase-3表達(dá)顯著減少， TLR4-siRNA+GEM組活性Caspase-3表達(dá)則顯著增加，提示TLR4具有抑制Caspase-3活化的作用，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT通路有關(guān)。

總之，異常表達(dá)的TLR4在胰腺癌PNAC1細(xì)胞對GEM的化療耐藥過程中起重要作用，其機(jī)制與激活PI3K/AKT通路，抑制Caspase-3活化有關(guān)。

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(本文編輯：屠振興)

Relationship between TLR4 and the sensitivity of pancreatic cancer PANC1 cells to gemcitabine

SunYunliang,YuYang,TongYili,WuHongyu,MaJianxia.

DepartmentofGastroenterology,ThePeople′sHospitalofGanyuCounty,Lianyungang222100,China

Correspondingauthor:MaJianxia,Email:yz_mjx@163.com

ObjectiveTo observe the relationship between Toll-like receptor 4 (TLR4) and the sensitivity of PANC1 cells to gemcitabine (GEM), and to analyze the potential mechanism. MethodsPANC1 cells were divided into GEM group, lipopolysaccharide (LPS)+GEM group and TLR4-siRNA+GEM group. GEM group was treated by GEM alone. LPS+GEM group was pretreated with 1 mg/L LPS for 4 h and then treated by GEM. TLR4-siRNA+GEM group was transfected with 100 pmol/mL TLR4-siRNA for 4 h and then treated by GEM. The untreated cells were used as the control group. MTT method was used to detect the cell proliferation. Morphological changes and apoptosis rate of the cells were examined by Hoechst33258 staining and flow cytometry, respectively. The protein expression of TLR4, phosphorylated AKT (p-AKT) and activated Caspase-3 were detected by Western blot. ResultsThe median inhibition concentration (IC50) of GEM in the GEM group, LPS+GEM group and TLR4-siRNA+GEM group was (8.9±0.32), (14.21±0.95), (3.96±0.27)mg/L, respectively. The IC50in LPS+GEM group was significantly higher than that in GEM group (P<0.01), and the IC50of GEM in TLR4-siRNA+GEM group was significantly lower than that in GEM group (P<0.01). Compared with that in GEM group, the cells with typical apoptotic morphological changes were decreased in LPS+GEM group, which was increased in TLR4-siRNA+GEM group. The apoptotic rate in control group, GEM group, LPS+GEM group, TLR4-siRNA+GEM group was (2.1±0.3)%, (15.1±2.3)%, (9.8±1.5)%, (22.9±3.1)%, respectively. Compared with that in GEM group, the cells apoptotic rate was significantly reduced in LPS+GEM group (P<0.01), which was significantly increased in TLR4-siRNA+GEM group (P<0.01). TLR4 protein level in the 4 groups was 0.83±0.08, 0.81±0.07, 0.85±0.07 and 0.16±0.03; p-AKT protein level 0.61±0.05, 0.36±0.03, 0.73±0.07 and 0.21±0.02; activated Caspase-3 protein level was 0.66±0.05, 0.73±0.07, 0.45±0.04 and 0.91±0.07, respectively. The expression of TLR4 and p-AKT in TLR4-siRNA+GEM group was significantly lower than that in GEM group (P<0.01), while the expression of activated Caspase-3 protein was increased significantly (P<0.05). Compared with the GEM group, the expression of p-AKT protein in LPS+GEM group was significantly increased (P<0.01), and the expression of activated Caspase-3 protein was significantly decreased (P<0.01). ConclusionsTLR4 can inhibit the sensitivity of pancreatic cancer PNAC1 cells to GEM, and the mechanism is related to the activation of PI3K/AKT pathway and down-regulation of activated Caspase-3.

Pancreatic neoplasms;Toll-like receptor 4;Drug resistance, neoplasm;Gemcitabine;Phosphorylated AKT;Activated Caspase-3

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.003

222100江蘇連云港，江蘇省連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(孫運(yùn)良)；上海復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科(虞陽、童依麗、馬建霞)；第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科(吳洪玉)

馬建霞，Email：yz_mjx@163.com

上海復(fù)旦大學(xué)華東醫(yī)院骨干基金(HDGG2014003)；連云港市衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(1427)

2016-01-25)