胡艷粉　趙曉婷　權(quán)曉娟　李秀麗　章琳　李領(lǐng)俠

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·論著·

人參皂苷Compound K治療糖尿病的機(jī)制研究

胡艷粉趙曉婷權(quán)曉娟李秀麗章琳李領(lǐng)俠

目的探討人參皂苷compound K(CK)干預(yù)對(duì)糖尿病小鼠糖脂代謝的影響及其可能的作用機(jī)制。方法36只小鼠按完全隨機(jī)法分為正常組，糖尿病組，人參皂苷CK 100、200 mg/kg體重治療組(治療1、2組)，二甲雙胍組，p38MAPK通路激動(dòng)劑P79350干預(yù)組，每組6只。采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲菌素方法建立小鼠糖尿病模型。制模后各組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)8周。8周后取血檢測(cè)空腹血糖、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血清胰島素水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)，行糖耐量試驗(yàn)。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰島組織凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)、磷酸化ASK1(p-ASK1)、p38、p-p38蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)胰島組織ASK1 mRNA表達(dá)。結(jié)果糖尿病組小鼠空腹血糖、TG、TC、HDL-C、空腹血清胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)分別為(28.31±3.40)、(1.90±0.28)、(5.00±0.72)、(0.50±0.08)、(9.01±1.70)mmol/L及-6.42±0.76；治療2組小鼠分別為(12.02±1.81)、(0.97±0.09)、(2.90±0.49)、(0.91±0.08)、(15.12±1.93)mmol/L及-4.33±0.46；二甲雙胍組分別為(12.87±2.61)、(1.09±0.11)、(3.08±0.27)、(0.87±0.08)、(14.97±1.27)mmol/L及-4.42±0.35。治療組空腹血糖、TG、TC水平均較糖尿病組顯著下降，而空腹血清胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，治療2組與二甲雙胍組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組、糖尿病組、治療2組小鼠胰島組織ASK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.07、2.52±0.14、1.25±0.08。糖尿病組、治療2組均較對(duì)照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而治療2組與糖尿病組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組、糖尿病組、治療2組小鼠胰島組織ASK1、p38蛋白表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但糖尿病組p-ASK1、p-p38蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)，而治療2組較糖尿病組顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，而治療2組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論人參皂苷CK具有改善糖尿病小鼠脂代謝的作用，其機(jī)制可能與抑制ASK1-p38MAPK通路成員的磷酸化有關(guān)。

人參皂苷甙類；糖尿?。籄SK1-p38-MAPK

糖尿病(diabetic mellitus，DM)是一種由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足而導(dǎo)致葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝紊亂的內(nèi)分泌代謝性疾病[1-2]。目前糖尿病的治療主要以應(yīng)用胰島素和口服降糖藥為主，但常伴有一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)[3]。因此，從天然藥物中尋找和開(kāi)發(fā)安全可靠的天然活性物質(zhì)對(duì)穩(wěn)定血糖、減少糖尿病并發(fā)癥、提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。人參是我國(guó)名貴中藥材，素有“百草之王”之美譽(yù)。近年來(lái)人參在糖尿病預(yù)防和治療中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。人參多糖、人參糖肽以及人參皂苷均被發(fā)現(xiàn)有降血糖活性[4-6]。人參皂苷Compound K(CK)作為人參二醇型皂苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是人參皂苷吸收入血、發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)[7]，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究應(yīng)用人參皂苷CK治療糖尿病小鼠，觀察其抗糖尿病活性，探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只雄性ICR小鼠，清潔級(jí)，體重(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于溫度20～25℃，濕度40%～70%的環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理學(xué)的要求。

ICR小鼠按完全隨機(jī)法分為對(duì)照組，糖尿病組，人參皂苷CK100、200 mg/kg體重治療組(治療1、2組)，二甲雙胍組，p38MAPK通路激動(dòng)劑P79350干預(yù)組，每組6只小鼠。除對(duì)照組外，其余5組均采用高糖高脂飼料(66.5%常規(guī)飼料，15%豬油，15%蔗糖，3%膽固醇，1%膽酸鹽，0.6%甲基硫氧嘧啶)喂養(yǎng)2周后禁食12 h，再腹腔注射鏈脲菌素(STZ)40 mg/kg體重方法制備小鼠糖尿病模型[8-9]。注射后繼續(xù)給予高脂高糖飲食72 h，再次禁食12 h，眼眶采血測(cè)血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L視為造模成功。兩治療組于造模第4天開(kāi)始分別給予相應(yīng)劑量的人參皂苷CK(四川維克奇生物科技有限公司)灌胃，連續(xù)8周；P79350組在每次給予200 mg/kg體重人參皂苷CK灌胃前30 min通過(guò)尾靜脈注射P79350(美國(guó)Calbiochem公司)0.2 μg/kg體重；糖尿病組給予等容積生理鹽水灌胃；二甲雙胍組給予50 mg/kg體重二甲雙胍灌胃。

二、空腹血糖、血脂和血清胰島素測(cè)定

治療8周后從眼部靜脈叢取血，離心收集血清，測(cè)定空腹血糖、空腹血清胰島素、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。所有檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。胰島素敏感指數(shù)=1/(空腹血糖×空腹血清胰島素)。

三、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)

治療8周后禁食12 h，從眼部取血收集血清，測(cè)血糖含量(0 min)，之后用40%葡萄糖溶液(2 g/kg體重)給小鼠灌胃，灌胃后30、60、90、120 min分別從眼部取血收集血清，測(cè)血糖含量。采用近似梯形面積法計(jì)算曲線下面積(AUC0～120 min)[10]。

四、胰島組織凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)、磷酸化ASK1(p-ASK1)、p38、p-p38蛋白表達(dá)檢測(cè)

治療8周后處死小鼠，取胰島組織，研磨、裂解、離心提取胰島組織總蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗小鼠ASK1、p-ASK1、p38、p-p38、β-actin多抗均購(gòu)自Abcam公司，工作濃度均為1∶800，山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1∶2 000。最后ECL發(fā)光，X膠片暗室曝光、顯影。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

五、胰島組織ASK1 mRNA表達(dá)檢測(cè)

取200 mg胰島組織，應(yīng)用Qiagen RNeasy mini試劑盒(Qiagen公司)提取總RNA，High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystems公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ASK1 mRNA表達(dá)量。ASK1正義引物5′-CGTGGACTTCTGGATGGATT-3′，反義引物5′-GACCTGGTTGCTCAGGTCTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物499 bp；內(nèi)參β-actin正義引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，反義引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物540 bp。引物由深圳華大基因公司合成。PCR反應(yīng)：94℃ 5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，應(yīng)用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對(duì)照基因。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、小鼠空腹血糖、血脂、血清胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)的變化

糖尿病組小鼠的空腹血糖、TG、TC水平均顯著高于對(duì)照組，而血HDL-C、空腹血清胰島素水平及素胰島素敏感指數(shù)均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。兩治療組空腹血糖、TG、TC水平均較糖尿病組顯著下降，而空腹血清胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。治療2組的空腹血糖顯著低于治療1組，而胰島素敏感指數(shù)顯著高于治療1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。P79350組小鼠的空腹血糖、TG、TC水平均顯著高于治療2組，而血HDL-C、空腹血清胰島素水平及素胰島素敏感指數(shù)均顯著低于治療2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。二甲雙胍組的血糖、血脂、血清胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)與治療2組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　各組小鼠血糖、血脂和血清胰島素的變化 ±s)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與糖尿病組比較,cP<0.05，dP<0.01;與治療2組比較，eP<0.05

二、小鼠糖耐量的變化

對(duì)照組血糖在給予葡萄糖30 min時(shí)達(dá)峰值，隨后逐漸降低，120 min時(shí)基本恢復(fù)到正常水平；糖尿病組血糖在60 min達(dá)峰值，120 min時(shí)仍未恢復(fù)正常，均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.456，P<0.05，圖1)；兩治療組、二甲雙胍組的血糖在60 min達(dá)峰值，但均較同時(shí)間點(diǎn)糖尿病組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而治療1組與二甲雙胍組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療2組與二甲雙胍組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　各組小鼠的葡萄糖耐量曲線

對(duì)照組、糖尿病組、治療1組、治療2組、二甲雙胍組的AUC0～120 min分別為(1 050±57)、(2 951±109)、(1 850±129)、(1 450±137)、(2 151±158)mmol·L-1·min-1，各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.052，P=0.009)。其中糖尿病組、治療1組、治療2組、二甲雙胍組均顯著大于對(duì)照組，治療2組顯著小于二甲雙胍組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，而治療1組與二甲雙胍組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、小鼠胰島組織的ASK1 mRNA表達(dá)的變化

對(duì)照組、糖尿病組、治療1組、治療2組小鼠胰島組織ASK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.07、2.52±0.14、1.51±0.15、1.25±0.08，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.345，P<0.05)。其中糖尿病組、治療1組、治療2組均較對(duì)照組顯著上調(diào)(P值均<0.01)，治療1組較糖尿病組顯著下調(diào)(P<0.05)，治療2組與糖尿病組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達(dá)變化

對(duì)照組、糖尿病組、治療1組、治療2組小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2及表2。各組間ASK1、p38蛋白表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病組p-ASK1與p-p38蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著上調(diào)，兩治療組又均較糖尿病組顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。治療1組p-ASK1、p-p38蛋白表達(dá)仍顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，而治療2組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2　對(duì)照組(1)、糖尿病組(2)、治療1組(3)、治療2組(4)小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達(dá)

糖尿病是以糖代謝紊亂為主要特征的疾病，除高血糖水平外，常伴有脂代謝異常，而高脂血癥的發(fā)生又會(huì)加劇胰島素抵抗，導(dǎo)致惡性循環(huán)。糖尿病患者的TC、TG以及HDL-C升高均可以誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[11]。流行病學(xué)研究表明，控制糖尿病患者的血糖、血脂異常在臨床上意義重大。本研究結(jié)果顯示，糖尿病小鼠制模成功后，小鼠的空腹血糖、TC、TG水平均顯著升高，與前期報(bào)道一致[12]。但本研究糖尿病小鼠的HDL-C水平顯著低于對(duì)照組，這與李曄[10]、齊密霞等[13]的報(bào)道一致。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠HDL-C水平僅略低于正常對(duì)照組，無(wú)顯著差異[9,14]。還有研究顯示糖尿病小鼠HDL-C水平顯著高于正常對(duì)照組[8,12]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因尚不得而知。

人參皂苷CK屬于稀有人參皂苷，由于其獨(dú)特的生物活性已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注，針對(duì)它的科學(xué)研究也日益增多，包括糖尿病的治療[15-17]。2012年，李偉[18]報(bào)道，人參皂苷CK對(duì)2型糖尿病有降血糖作用及肝糖異生的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷CK可降低糖尿病小鼠血糖、TC、TG水平，增加HDL-C、胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)，改善糖尿病小鼠的糖耐量，療效與二甲雙胍治療無(wú)顯著差異，證實(shí)人參皂苷CK對(duì)糖尿病有治療作用。

表2　各組小鼠胰島組織ASK1、p-ASK1、p38、p-p38蛋白表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與糖尿病組比較,cP<0.05，dP<0.01

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞信息傳遞的重要通路，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分泌、細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19]。ASK1是p38MAPK通路的上游激酶，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。在糖尿病方面，p38MAPK與糖、脂代謝密切相關(guān)。p38可以磷酸化糖原合酶，部分抑制其活性，進(jìn)而影響糖原的合成。活化的p38還能活化轉(zhuǎn)錄輔助激活因子PGC-1α，進(jìn)而激活糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G-6-Pase的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)糖異生作用，這可能是糖尿病狀態(tài)下糖異生作用較強(qiáng)的原因之一[20]。p38MAPK還能通過(guò)調(diào)控葡萄糖進(jìn)入肌細(xì)胞內(nèi)所需的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-4的表達(dá)水平而調(diào)節(jié)糖代謝[21]。在脂質(zhì)代謝方面，p38MAPK可以抑制脂質(zhì)合成，還能通過(guò)激活PPAR-α而促進(jìn)脂質(zhì)的β氧化[20]。已有研究表明，ASK1-p38MAPK通路參與胰島損傷誘發(fā)的糖尿病發(fā)生[22]。近期研究又發(fā)現(xiàn)ASK1-p38MAPK在糖尿病誘發(fā)的腎功能損傷中也發(fā)揮重要作用[23]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病小鼠胰島組織ASK1和p38的磷酸化水平較對(duì)照組顯著升高，而人參皂苷CK能夠抑制它們的磷酸化，提示人參皂苷CK能夠阻礙被激活的ASK1-p38MAPK通路。進(jìn)一步的結(jié)果顯示，p38MAPK特異性激動(dòng)劑P79350能夠減緩人參皂苷CK對(duì)糖尿病小鼠血糖和血脂水平的抑制作用，同時(shí)增強(qiáng)糖尿病小鼠胰島素敏感指數(shù)。因此，人參皂苷CK可能是通過(guò)抑制胰島組織ASK1-p38MAPK通路抑制凋亡，維持胰島細(xì)胞的數(shù)量和功能，增加胰島素分泌量降低空腹血糖，緩解糖尿病癥狀。

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(本文編輯：屠振興)

The mechanism of treatment effect of ginsenoside compound K on diabetic mellitus

HuYanfen,ZhaoXiaoting,QuanXiaojuan,LiXiuli,ZhangLin,LiLingxia.

TheCadre′sWard,SecondAffiliatedHospital,MedicalCollegeofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

Correspondingauthor:LiLingxia,Email: 1633529972@qq.com

ObjectiveTo investigate the treatment effect of ginsenoside compound K (CK) on glucose and lipid metabolism in diabetic mellitus mice and the potential molecular mechanism. MethodsA total of 36 mice were randomly divided into normal group, diabetic mellitus group, CK treatment groups (100 or 200 mg/kg body weight), dimethyldiguanide group and p38MAPK pathway agonist P79350 group, with 6 mice in each group. Diabetic mice were established by intraperitoneal injection of streptozotocin combined with high-fat diet, and CK with different doses was administrated by gastric lavage for consecutive 8 weeks. The levels of fasting blood-glucose, triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL C), fasting serum insulin were measured,and the insulin sensitive index (ISI) was calculated in different treatment groups. Glucose tolerance was detected by oral glucose tolerance test. The protein levels of ASK1, p-ASK1 and p38, p-p38, was detected by Western blot. The mRNA expression of apoptosis signal regulating kinase-1 (ASK1) was detected by real-time quantitative PCR. ResultsThe fasting blood-glucose, TG, TC, HDL C, fasting serum insulin and ISI were (28.31±3.40), (1.90±0.28), (5.00±0.72), (0.50±0.08), (9.01±1.70)mmol/L and -6.42±0.76 in diabetic mice, respectively. The corresponding values were (12.02±1.81), (0.97±0.09), (2.90±0.49), (0.91±0.08), (15.12±1.93)mmol/L and -4.33±0.46 in 200 mg/kg CK treatment diabetic mice, and were (12.87±2.61), (1.09±0.11), (3.08±0.27), (0.87±0.08), (14.97±1.27)mmol/L and -4.42±0.35 in dimethyldiguanide group. All of the fasting blood-glucose, TG and TC in CK treatment groups were significantly lower than those of diabetic mellitus group (P<0.05 or <0.01), but the fasting serum insulin and ISI in CK treatment groups were significantly higher than that of diabetic mellitus group (P<0.05 or <0.01). There were no significant difference between 200 mg/kg CK treatment group and dimethyldiguanide group. The mRNA levels of ASK1 in normal group, diabetic mellitus group and 200 mg/kg CK treatment group were 1.00±0.07, 2.52±0.14 and 1.25±0.08, respectively. The mRNA levels of ASK1 in diabetic mellitus group and 200 mg/kg CK treatment group were significantly up-regulated than that of normal group (P<0.01), but there was no significant difference between 200 mg/kg CK treatment group and diabetic mellitus group in the mRNA levels of ASK1. There was no significant difference in the protein expression levels of ASK1 and p38 among normal group, diabetic mellitus group and 200 mg/kg CK treatment group, but the protein expression levels of p-ASK1 and p-p38 were significant higher in diabetic mellitus group than that in normal group (P<0.05 or <0.01),and were significant lower in 200 mg/kg CK treatment group than that in diabetic mellitus group (P<0.05 or <0.01),and were no significant difference between 200 mg/kg CK treatment group and normal group. ConclusionsGinsenoside CK effectively attenuates diabetic mellitus in mouse model, possibly by inhibiting the phosphorylation of ASK1-p38MAPK signaling pathway.

Ginsenosides;Diabetes mellitus;ASK1-p38-MAPK

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.011

710004西安，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部病房三病區(qū)

李領(lǐng)俠，Email: 1633529972@qq.com

2015-04-20)