王　平，陳寧生（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖　241000；2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽蕪湖　241000）

計(jì)算機(jī)輔助高效液相色譜法對(duì)食品中7種防腐劑的檢測(cè)

王平1，2，陳寧生1?
（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽蕪湖241000）

在計(jì)算機(jī)輔助下，建立食品中7種防腐劑的高效液相色譜檢測(cè)方法.食品通過(guò)提取，離心，固相萃取凈化，計(jì)算機(jī)輔助高效液相色譜優(yōu)化分離后，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行鑒定，并依據(jù)外標(biāo)法定量.檢測(cè)器響應(yīng)值與防腐劑的濃度在一定范圍內(nèi)均有良好的線(xiàn)性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均在0.999以上.食品中7種防腐劑的回收率在90.4%～93.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在1.5～6.4%之間.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)縮短了色譜條件的優(yōu)化時(shí)間，顯著提高了檢測(cè)效率，同時(shí)由于該方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度，因此，可適用于單種或多種防腐劑同時(shí)測(cè)定.

防腐劑；高效液相色譜；計(jì)算機(jī)輔助

為了保障食品的安全性及其功能化，GB2760-2014（簡(jiǎn)稱(chēng)“標(biāo)準(zhǔn)”）［1］明確限定了食品添加劑種類(lèi)及添加量.但是在食品中超劑量使用防腐劑，甚至是添加一些非法添加劑仍時(shí)有發(fā)生.目前，食品中防腐劑的檢測(cè)方法主要有HPLC法［2-5］、GC或GC-MS法［6-9］、毛細(xì)管電泳法［10］、離子色譜法［11］等.檢測(cè)方法大多針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中允許的苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鉀鹽、脫氫乙酸及其鈉鹽、對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽、丙酸及其鈉（鈣）鹽等［12］，且只是對(duì)指定食品中的一種或幾種防腐劑進(jìn)行檢測(cè)，不能對(duì)食品進(jìn)行全面的檢測(cè)，特別對(duì)非法添加的防腐劑缺乏有效檢測(cè).因此，這些檢測(cè)方法具有一定的局限性.建立一種能對(duì)多種食品中一種或多種防腐劑同時(shí)檢測(cè)的方法就顯得尤為重要.

實(shí)驗(yàn)選擇國(guó)家允許使用、易濫用的常見(jiàn)防腐劑（如苯甲酸、2，4-二氯苯氧乙酸（簡(jiǎn)稱(chēng)24D）、桂醛、聯(lián)苯醚），禁止作為食品防腐劑的水楊酸、苯甲醇，以及明令禁止使用且危害較大的富馬酸二甲酯作為檢查對(duì)象，利用計(jì)算機(jī)輔助優(yōu)化分離條件，建立高效液相色譜—二極管整列檢測(cè)器對(duì)多種食品中7種防腐劑同時(shí)且快速檢測(cè)和方法.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀LC-20 A（日本島津公司）；配有二極管陣列檢測(cè)器（SPD-M20A）；甲醇為色譜純（美國(guó)TEDIA公司）；標(biāo)準(zhǔn)品分別購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心和中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；水為實(shí)驗(yàn)室用一級(jí)水；其余試劑均為分析純；液相色譜柱、Pro Elut PXA混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱及其他固相萃取小柱（簡(jiǎn)稱(chēng)SPE小柱）均購(gòu)自迪馬公司；實(shí)驗(yàn)所用食品樣品均購(gòu)自蕪湖市場(chǎng).

1.2試驗(yàn)方法

（1）標(biāo)樣溶液的配制.用甲醇將精準(zhǔn)稱(chēng)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解，并轉(zhuǎn)移至容量瓶中用甲醇定容作為儲(chǔ)備液，于4℃下保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)制備成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并稀釋至所需濃度.

（2）樣品處理.準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確至0.000 1 g）左右樣品置于50 m L離心管中，加入20 m L乙醇水溶液（1∶1），40 KHz超聲15 min，以500 0 r/min離心10 min，上清液待凈化.

（3）凈化.依次向ProElut PXA小柱中加入3 m L甲醇、3 m L水，加入5 m L樣品溶液，用5 m L水淋洗，3 m L甲酸甲醇水（2∶80∶20）溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，流動(dòng)相定容至1 m L.

（4）色譜條件.色譜柱：Platisil ODS 5μm 250×4.6 mm；保護(hù)柱：EasyGuard Kit C18；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液梯度洗脫，洗脫程序如表1所示；進(jìn)樣量10μL；流速為1.0 m L/min；柱溫為30℃；采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè).

表1　流動(dòng)相梯度洗脫程序

（5）定性和定量.根據(jù)保留時(shí)間及紫外光譜進(jìn)行定性，用外標(biāo)峰面積法進(jìn)行定量.

2　結(jié)果與討論

2.1樣品防腐劑提取條件

選擇合適的提取溶劑可以提高防腐劑的提取效率和方法的準(zhǔn)確度.考慮到研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)特性，分別采用甲醇、1+1乙醇、正己烷、乙醚作提取溶劑試驗(yàn).然而試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙醚、正己烷等可能將食品樣品中脂肪等干擾物質(zhì)帶入，同時(shí)甲醇極性較大，因此兼顧SPE小柱的性質(zhì)，選擇1+1乙醇水溶液提取.

2.2固相萃取柱的選擇

使用混合標(biāo)樣過(guò)柱，對(duì)比PWA和PXA兩種混合型小柱，結(jié)果如表2所示.由表2可知，PWA對(duì)酸性較強(qiáng)的苯甲酸、水楊酸、24D保留效果欠佳，回收率不足50%；PXA對(duì)各組分的保留性和洗脫性都比較理想.因此，選擇ProElutPXA混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱作為實(shí)驗(yàn)凈化小柱.

表2　固相萃取效率

2.3檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

基于被測(cè)的7種物質(zhì)單標(biāo)進(jìn)樣都具有較強(qiáng)的紫外吸收，選擇二極管陣列作為檢測(cè)器，掃描得到各物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)如表3所示.考慮檢測(cè)波長(zhǎng)低于210 nm時(shí)，檢測(cè)體系本底響應(yīng)較大.同時(shí)兼顧紫外吸收強(qiáng)度、本底響應(yīng)和方便檢測(cè)，因此選定苯甲酸、水楊酸、24D、桂醛、聯(lián)苯醚檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，苯甲醇、富馬酸二甲酯檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm.

表3　最大吸收波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)

2.4流動(dòng)相及溫度的選擇

比較甲醇-水、甲醇-磷酸鹽、甲醇-乙酸銨流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇水體系中水楊酸、24D無(wú)保留；甲醇乙酸銨比甲醇磷酸鹽能獲得更好的分離效果，所以選擇0.02 mol/L乙酸銨+甲醇作為流動(dòng)相.引入柱溫和流動(dòng)相比例兩個(gè)因素，分別在30℃、45℃下30 min和60 min內(nèi)，甲醇相從5%勻速增至95%.分別用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣得到各組分保留時(shí)間和峰面積，借助計(jì)算機(jī)色譜模擬軟件Dry Lab，通過(guò)調(diào)節(jié)梯度曲線(xiàn)和溫度模擬分離可得到最佳分離溫度30℃和梯度洗脫程序如圖1所示.

混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖如圖2所示.計(jì)算機(jī)模擬色譜分離效果，既可以縮短色譜條件探討時(shí)間，也可以減少試劑消耗，最終降低檢測(cè)成本.

圖1　色譜條件優(yōu)化結(jié)果圖

圖2　混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

2.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)樣，在柱溫30℃條件下，按照表1中梯度洗脫程序進(jìn)樣，以保留時(shí)間定性，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性擬合得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表4所示.

表4　防腐劑保留時(shí)間、線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)（n=6）及檢出限

2.6準(zhǔn)確度

以綠豆糕為樣品做標(biāo)準(zhǔn)添加回收實(shí)驗(yàn)，每種物質(zhì)進(jìn)行6次平行測(cè)定，計(jì)算回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表5所示，加標(biāo)色譜圖如圖3所示.

表5　防腐劑的添加回收率及其RSD（n=6）

2.7樣品分析

對(duì)糕點(diǎn)、醬腌菜、蜜餞、豆制品、調(diào)味料、肉制品6大類(lèi)食品，每類(lèi)10組樣品，共計(jì)60組樣品的7種防腐劑同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)2次，其中6組蜜餞（分別為0.11 g/kg、0.24 g/kg、0.42 g/kg、0.36 g/kg、0.25 g/kg、0.40 g/kg）、5組醬腌菜（分別為0.33 g/kg、0.43 g/kg、0.54 g/kg、0.13 g/kg、0.35 g/kg）、5組調(diào)味品（分別為0.22 g/kg、0.37 g/kg、0.41 g/kg、0.28 g/kg、0.31 g/kg）中有苯甲酸檢出，水楊酸、苯甲醇、富馬酸二甲酯、24D、桂醛、聯(lián)苯醚均未檢出.同時(shí)使用現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，所有結(jié)果相對(duì)誤差均小于一般色譜平行樣10%的要求，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果及方法是可靠的.

圖3　加標(biāo)回收色譜圖

3　小結(jié)

實(shí)驗(yàn)方法前處理大為簡(jiǎn)化，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7種防腐劑在色譜柱上分離度較好，實(shí)驗(yàn)平行性較佳、回收率較好.檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、精密度較高，且檢測(cè)速度快，可對(duì)食品中多種防腐劑同時(shí)測(cè)定.計(jì)算機(jī)輔助有效地縮短了時(shí)間，節(jié)約了化學(xué)試劑用量，為其他樣品的檢測(cè)提供了可能.

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2014.

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Computer-aided Determination of Seven Preservatives in Food by HPLC

WANG Ping1，2，CHEN Ning-sheng1?
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China 2.Wuhu Institute of Product Quality Supervision，Wuhu 241000，China）

A HPLC method to determine seven kinds of preservatives in food was established with computer softwares.Preservatives in food were extracted，centrifuged and SPE purified.The sample solutions were optimally separated by HPLC with computer softwares.Preservatives were analyzed by using the qualitative PDA and quantitative external standard methods.Within a certain range，a good linear correlation was found between the response values and preservative concentration.And their correlation coefficients were above 0.999.The recovery ratios of seven kinds of preservatives in food were between 90.4%～93.8%，and their RSD were between 1.5～6.4%.Results showed that the separation efficiency of preservatives was improved.Therefore，the method can be applied to determine single or multiple preservatives due to its high precision and accuracy.

preservatives；high performance liquid chromatographic（HPLC）；computer aid method

TS207

A

1672-2477（2016）04-0068-05

2016-02-22

王平（1986-），男，安徽蕪湖人，碩士研究生.

通訊簡(jiǎn)介：陳寧生（1958-），女，江蘇南京人，教授，碩導(dǎo).