萬　強(qiáng)，楊玉萍，劉中勇（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院.心血管病科、.肺病科，江西南昌　330006）

大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制

萬強(qiáng)1，楊玉萍2，劉中勇1
（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院1.心血管病科、2.肺病科，江西南昌330006）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.038.html

目的探討PM2.5對EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及大蒜素的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采集大氣PM2.5分別以20、200、400 mg·L-1染毒EA.hy926細(xì)胞24 h，MTT法測細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡；Western blot法測p-ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白水平；ELISA法測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量，并測細(xì)胞丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脫氫酶（LDH）活性；分別加入大蒜素（5、20、40 mg·L-1）和ERK1/ 2通路特異性阻滯劑PD98059 20 μmol·L-1，檢測大蒜素的干預(yù)作用及機(jī)制。結(jié)果與對照組比較，PM2.5染毒后呈劑量依賴性降低EA.hy926細(xì)胞存活率，上調(diào)p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)分泌TNF-α及IL-6含量增高，降低SOD活性，增加MDA含量及LDH活性（P＜0.05）；大蒜素呈劑量依賴性增加EA.hy926細(xì)胞的存活率，下調(diào)p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制細(xì)胞凋亡，降低TNF-α及IL-6含量，增加SOD活性，降低MDA含量及LDH活性（P＜0.05）。結(jié)論大蒜素可能通過抑制ERK1/2信號通路，減輕PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)EA.hy926細(xì)胞。

PM2.5；大蒜素；ERK1/2信號通路；EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；氧化應(yīng)激損傷

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變是心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。在AS病變過程中，從脂質(zhì)條紋、纖維斑塊和粥樣斑塊，到不穩(wěn)定斑塊的破裂及血栓形成，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷始終貫穿其中［1］。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷被視為AS始動病理環(huán)節(jié)，受損的內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥和氧化應(yīng)激刺激下可吸附單核細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)成為成泡沫細(xì)胞，形成脂質(zhì)斑塊，使動脈管腔狹窄，管壁失去彈性形成AS［2］。PM2.5是大氣中空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物，也稱可入肺顆粒物。研究表明，吸入PM2.5可加重炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷而促進(jìn)AS形成及發(fā)展。長期暴露在PM2.5環(huán)境可抑制載脂蛋白E基因敲除小鼠血漿高密度脂蛋白的抗炎能力，并明顯增加肝臟丙二醛（malonaldehyde，MDA）和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)控的抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，而促進(jìn)AS形成［3］。

大蒜素（allicin）是從蔥科蔥屬植物大蒜（Allium Sativum）的鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化合物，也存在于洋蔥及其他蔥科植物中。既往研究表明，大蒜素可通過抑制炎癥因子分泌、清除自由基抗氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抑制泡沫細(xì)胞形成等多途徑發(fā)揮抗AS效應(yīng)［4］，但其機(jī)制尚未完全闡明。本實驗觀察PM2.5對EA.hy926型人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，加用大蒜素和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）信號通路特異性阻滯劑PD98059干預(yù)，探討大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926細(xì)胞的干預(yù)作用及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫，增殖周期約為31 h，批號2922。

1.1.2藥品與試劑大蒜素購自北京索萊寶科技有限公司，純品為無色油狀物，相對分子質(zhì)量為162，批號150603；二甲基亞砜（DMSO）和噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；p-ERK1/2、Bcl-2、Bax和β-actin抗體購自美國Cell Signal Technology公司；Annexin V-FITC試劑盒購自美國Bio Vision公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司；MDA、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器ST16R型低溫高速離心機(jī)、3111型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱和MK3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；MiniVol型便攜式PM2.5采樣器購自美國Airmetrics公司；165-1801型電泳儀購自美國Bio-Rad公司；石英纖維濾膜購自美國Whatman公司；TY7350型流式細(xì)胞儀購自美國ACEA Biosciences公司；IX71型熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2方法

1.2.1PM2.5的采集與制備參照廣州市環(huán)保局發(fā)布的PM2.5監(jiān)測數(shù)據(jù)，于空氣質(zhì)量指數(shù)5級及以上PM2.5嚴(yán)重超標(biāo)的霧霾天氣，在廣州市距離地面約50 m高建筑樓頂用PM2.5采樣器以流量為5 L ·min-1進(jìn)行24 h·d-1采樣，連續(xù)采樣3 d。將石英纖維濾膜剪成1 cm×3 cm大小置于去離子水，超聲震蕩30 min×3次，用6層無菌紗布過濾提取液，以10 000 r·min-1于4℃離心20 min，收集提取物真空冷凍，并干燥成干粉，稱重，-20℃避光保存。加滅菌PBS配制成質(zhì)量濃度分別為20、200、400 mg· L-1的PM2.5混懸液。

1.2.2細(xì)胞分組及處理設(shè)PM2.5不同質(zhì)量濃度組，分別以0、20、200、400 mg·L-1PM2.5作用EA. hy926細(xì)胞24 h［5］。藥物干預(yù)組設(shè)① 對照組；②PM2.5組：PM2.5混懸液200 mg·L-1染毒24 h；③～⑤分別為PM2.5+大蒜素低、中、高劑量組：大蒜素用DMSO溶解并分別以5、20、40 mg·L-1預(yù)處理細(xì)胞1 h［6］后，再加PM2.5 200 mg·L-1染毒24 h；⑥PM2.5+PD98059組：PD98059 20 μmol·L-1預(yù)處理細(xì)胞30 min［7］后，再加PM2.5 200 mg·L-1染毒24 h。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞存活率EA.hy926細(xì)胞密度調(diào)至每孔1×104個，接種至96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后撤去血清。PM2.5混懸液不同質(zhì)量濃度染毒后加入20 μL MTT溶液（PBS溶解，濃度為5 g·L-1）室溫培養(yǎng)4 h，每孔加150 μL DMSO使還原產(chǎn)物完全溶解，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀測波長570 nm處各孔吸光度A。細(xì)胞存活率/%=［A（實驗組）-A（空白對照組）/A（對照組）-A（空白對照組）］×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡EA.hy926細(xì)胞密度調(diào)至每孔2×105個接種至12孔培養(yǎng)板24 h，每組設(shè)6個復(fù)孔，加不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌5 min×2次，加Annexin V-FITC 及PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5EA.hy926細(xì)胞TNF-α、IL-6及MDA含量、SOD、LDH活性的測定取對數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞以1×108·L-1接種于培養(yǎng)皿。收集細(xì)胞，以1 000 r·min-1離心10 min，去除培養(yǎng)液，以2 mL PBS洗1次后，加PBS 500 μL混懸。超聲5 s×5次，使細(xì)胞破碎，黃嘌呤氧化酶法檢測細(xì)胞裂解液中SOD活性。收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測TNF-α 及IL-6含量，硫代巴比妥法檢測MDA含量，比色法檢測LDH活性，操作步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.6Western blot法檢測Bax、Bcl-2、p-ERK1/2蛋白水平提取EA.hy926細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣品煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，加一抗于4℃反應(yīng)過夜，洗膜3次，加二抗于室溫結(jié)合，化學(xué)發(fā)光檢測。以β-actin做內(nèi)參蛋白，Quantity One軟件分析各條帶吸光度。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni法。

2　結(jié)果

2.1PM2.5對EA.hy926細(xì)胞的影響

2.1.1對EA.hy926細(xì)胞存活率的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯降低EA.hy926細(xì)胞存活率（P＜0.05），見Tab 1。

2.1.2對EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡（P＜0.05），見Tab 1。

2.1.3對EA.hy926細(xì)胞TNF-α、IL-6及MDA含量、SOD、LDH活性的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯降低EA.hy926細(xì)胞內(nèi)SOD活性（P＜0.05），明顯增加細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性（P＜0.05），見Tab 1。

2.1.4對EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-ERK1/2蛋白水平的影響與對照組比較，200、400 mg·L-1PM2.5染毒24 h均可明顯增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax 及p-ERK1/2蛋白水平，并明顯減少Bcl-2蛋白水平，增加Bax/Bcl-2蛋白比率（P＜0.05），見Fig 1。

2.2大蒜素對PM2.5損傷EA.hy926細(xì)胞的干預(yù)作用

2.2.1對PM2.5降低EA.hy926細(xì)胞存活率的干預(yù)作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol·L-1PD98059對于PM2.5降低EA.hy926細(xì)胞存活率均有明顯的拮抗作用（P＜0.05），見Tab 2。

2.2.2對PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol·L-1PD98059均可明顯減少由PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡（P＜0.05），見Tab 2。

Tab 1　Effects of different concentrations of PM2.5 on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

Tab 1　Effects of different concentrations of PM2.5 on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

*P＜0.05 vs control group

Group　Viability/%　Apoptosis/%　TNF-α/ng·L-1　IL-6/ng·L-1　MDA/μmol·L-1SOD/kU·L-1　LDH/kU·L-1Control　100　2.07±0.33　162.75±14.31　348.45±15.48　1.21±0.36　18.12±0.93　0.63±0.04 20 mg·L-1　98.71±0.57　2.10±0.36　164.51±13.92　351.34±15.96　1.23±0.39　18.09±1.08　0.63±0.05 200 mg·L-1　82.37±3.36*　21.35±0.87*　352.33±15.63*502.73±17.16*　4.27±0.45*　11.64±0.78*　1.05±0.05*400 mg·L-1　63.42±3.69*　42.07±1.62*　408.20±16.77*564.59±18.03*　5.46±0.42*　8.43±0.63*　1.45±0.05*

Tab 2　Effects of different concentrations of allicin on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

Tab 2　Effects of different concentrations of allicin on viability，apoptosis，IL-6，TNF-α and MDA contents，SOD and LDH activities in EA.hy926 cell（±s，n=3）

The concentration of PM2.5 was 200 mg·L-1.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group

Group　Viability/%　ApoptosisTNF-αIL-6MDASODLDH /%/ng·L-1/ng·L-1/μmol·L-1/kU·L-1/kU·L-1Control　100　2.05±0.36　162.43±14.04　349.56±15.42　1.22±0.36　18.15±0.96　0.63±0.04 PM2.5　82.35±3.33*　21.37±0.84*　353.42±15.75*　504.52±17.07*　4.26±042*　11.59±0.84*　1.05±0.04*PM2.5+allicin 5 mg·L-1　82.41±3.42*　21.30±0.75*　351.23±16.02*　502.46±15.72*　4.22±0.39*　11.62±0.78*　1.05±0.05*PM2.5+allicin 20 mg·L-1　87.92±3.15*#　15.16±0.84*#303.30±17.76*#448.02±14.61*#　3.28±0.45*#　14.63±0.93*#　0.94±0.06*#PM2.5+allicin 40 mg·L-1　91.32±2.13*#　11.72±0.66*#242.18±16.74*#388.15±15.33*#　2.21±0.33*#　16.90±0.84*#　0.75±0.05*#PM2.5+PD98059 20 μmol·L-186.84±3.09*#　16.96±0.63*#322.69±18.06*#462.64±16.08*#　3.39±0.48*#　13.98±0.81*#　0.96±0.05*#

Fig 1　Effects of different concentrations of PM2.5 on protein levels of p-ERK1/2，Bax and Bcl-2 in EA.hy926 cell（±s，n=3）

2.2.3對PM2.5影響EA.hy926細(xì)胞TNF-α、IL-6 及MDA含量、SOD、LDH活性的干預(yù)作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol· L-1PD98059均可明顯增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)SOD活性，明顯降低細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性（P＜0.05），見Tab 2。

2.2.4對PM2.5影響EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-ERK1/2蛋白水平的干預(yù)作用與PM2.5組比較，20、40 mg·L-1大蒜素和20 μmol·L-1PD98059均可明顯降低EA.hy926細(xì)胞內(nèi)Bax及p-ERK1/2蛋白水平，并明顯增加Bcl-2蛋白水平，減少Bax/ Bcl-2蛋白比率（P＜0.05），見Fig 2。

Fig 2　Effects of different concentrations of allicin on protein levels of p-ERK1/2，Bax and Bcl-2 in EA.hy926 cell（±s，n=3）

3　討論

PM2.5主要來源于汽車尾氣、石化燃料燃燒及香煙煙霧等，可長時間停留于大氣中。PM2.5粒徑小，富含大量有害有毒化學(xué)物質(zhì)、細(xì)菌、病毒可經(jīng)呼吸通過黏附作用穿過細(xì)胞膜迅速擴(kuò)散至整肺，通過肺氣血屏障進(jìn)入毛細(xì)血管并滲透到血細(xì)胞內(nèi)，擴(kuò)散到心血管，隨著循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散至微血管，作用于血管內(nèi)皮。多中心、多種族臨床對照試驗證實，長期慢性暴露在高濃度PM2.5環(huán)境中，可通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)興奮性增加等機(jī)制，增加動脈內(nèi)膜中層厚度、降低AS斑塊穩(wěn)定性，促進(jìn)此人群AS的形成及發(fā)展［8-9］。動物研究亦發(fā)現(xiàn)接觸高濃度PM2.5可上調(diào)清道夫受體CD-36的表達(dá)，誘導(dǎo)粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇堆積；促進(jìn)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加內(nèi)臟脂肪素表達(dá)，加速易損斑塊的不穩(wěn)定及破裂等，進(jìn)而促進(jìn)AS的形成［10-11］。

氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡是維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素。SOD是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子，減輕活性氧（reactive oxygen species，ROS）損害，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，其活性的高低可反映機(jī)體抗氧化損傷能力。脂質(zhì)在自由基作用下可發(fā)生過氧化反應(yīng)，其不飽和脂肪酸氧化終產(chǎn)物為MDA，可引起核酸及蛋白質(zhì)等生命大分子交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，MDA含量的高低可反映內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的嚴(yán)重程度。LDH存在于內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶受到影響，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞外液LDH漏出量相應(yīng)增加，因此LDH含量的高低可反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。炎癥反應(yīng)可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)AS發(fā)生及進(jìn)展，其病理特征是在血管內(nèi)皮，通過炎癥信號途徑完成炎癥因子及黏附因子的釋放，使炎性細(xì)胞浸潤，并激活進(jìn)一步級聯(lián)式炎癥反應(yīng)［12］。TNF-α及IL-6在AS慢性炎癥中扮演了重要角色，對巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞的遷移和激活起了調(diào)控作用，并能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而參與 AS形成［13］。在Bcl-2基因家族蛋白中，促凋亡基因蛋白Bax和抑凋亡基因蛋白Bcl-2，Bax/Bcl-2比值的高低對細(xì)胞凋亡起了直接的調(diào)控作用［14］。本研究顯示PM2.5染毒EA.hy926細(xì)胞后，可明顯降低細(xì)胞內(nèi)SOD活性，增加細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性，明顯降低EA.hy926細(xì)胞存活率、增加細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白比率以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證實PM2.5可通過氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)途徑誘導(dǎo)EA. hy926細(xì)胞損傷。

炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷均可激活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡信號級聯(lián)通路以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ERK1/2通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）家族分支之一，在構(gòu)建細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中起了重要作用，該通路的激活可通過增加血管平滑肌細(xì)胞增殖及炎性因子浸潤等促進(jìn)AS形成［15］。本研究顯示PM2.5染毒可明顯增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2蛋白水平，證實PM2.5誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞損傷可能與激活ERK1/2通路有關(guān)。

大蒜素可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路降低C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）分泌而抑制炎癥反應(yīng)；清除ROS而抗氧化應(yīng)激損傷；抑制膽固醇合成途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA還原酶）活性，阻斷脂質(zhì)過氧化而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝；抑制粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞對低密度脂蛋白的降解及吸收，減少泡沫細(xì)胞的形成等多途徑發(fā)揮抗AS作用［16-18］，但大蒜素是否可通過抑制ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減輕PM2.5誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷而抗 AS尚不清楚。PD98059可抑制ERK的上游激酶，并與非活化形式的MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）結(jié)合以抑制MKK的激活與磷酸化，發(fā)揮特異性阻斷ERK1/2信號通路的作用。本研究結(jié)果證實，與PM2.5組比較，大蒜素及PD98059均可不同程度拮抗PM2.5降低EA.hy926細(xì)胞存活率、降低Bax/Bcl-2基因蛋白比率以抑制EA.hy926細(xì)胞凋亡、降低EA.hy926細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2蛋白水平、增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)SOD活性，降低細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MDA含量及LDH活性，提示大蒜素抗AS機(jī)制之一可能是通過抑制ERK1/2信號通路，減輕PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，此發(fā)現(xiàn)有望為大蒜素在AS防治中的應(yīng)用提供新依據(jù)。大蒜素的抗AS作用機(jī)制及臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)實驗及臨床研究得以明確。

（致謝：本實驗主要在江西中醫(yī)藥大學(xué)的國家中藥臨床藥理研究基地完成，感謝各位老師對本實驗的幫助和指導(dǎo)。）

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hy926 endothelial cell injury induced by PM2.5 and its mechanism may be related to the attenuations of inflammation and oxidative stress via the inhibition of ERK1/2 pathway.

Allicin prevents EA.hy926 endothelial cell injury induced by PM2.5 via inhibiting ERK1/2 pathway

WAN Qiang1，YANG Yu-ping2，LIU Zhong-yong1
（1.Dept of Medical Cardiology，2.Dept of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330006，China）

AimTo investigate the protective effect of allicin against EA.hy926 endothelial cell injury induced by PM2.5 and the possible mechanism.MethodsThe samples of fine particulate matter（PM2.5）were collected and made into suspension.Different concentrations of PM2.5（20，200，400 mg·L-1）were added to EA.hy926 cell.The viability and apoptosis of EA.hy926 cell，the protein levels of p-ERK1/ 2，Bax and Bcl-2 in the EA.hy926 cell，the contents of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6），and malonaldehyde（MDA），the activities of superoxide dismutase（SOD）and lactic dehydrogenase（LDH）in the EA.hy926 cell culture supernatant were measured by MTT assay，flow cytometry，Western blot，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and colorimetry，respectively.Allicin at different concentrations（5，20，40 mg·L-1）or a specific inhibitor of ERK1/2 signaling pathway PD98059（20 μmol· L-1）was added into the EA.hy926 cell to observe the effect of allicin.ResultsCompared with control group，PM2.5 significantly increased the apoptosis，the contents of TNF-α，IL-6 and MDA，the activity of LDH，the protein levels of p-ERK1/2 and Bax/Bcl-2 ratio，but decreased the viability and SOD activity inthe EA.hy926 cell（P＜0.05）.Compared with PM2.5 group，allicin significantly decreased the apoptosis，the contents of TNF-α，IL-6 and MDA，the activity of LDH，the protein levels of p-ERK1/2 and Bax/Bcl-2 ratio，but increased the viability and SOD activity in the EA.hy926 cell（P＜0.05）.ConclusionAllicin displays a significant protective effect against EA.

PM2.5；allicin；ERK1/2 signaling pathway；EA.hy926 cell；inflammation；oxidative stress

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.019

A

1001-1978（2016）05-0692-06

R284.1；R122.7；R322.123；R329.25；R364.5；R392.12；R543.5

2015-12-25，

2016-01-27

國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81460680）；江西省科技計劃項目（No 20135BBG70002）

萬強(qiáng)（1985-），男，博士，醫(yī)師，研究方向：心血管疾病的臨床及實驗，通訊作者，E-mail：wanqiang109559140@ 163.com