伏簫燕，李海燕，崔　婷，蔣青松，邱紅梅（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶　400016）

CUS致大鼠抑郁行為涉及TNF-α及IDO-HAAO通路激活

伏簫燕，李海燕，崔婷，蔣青松，邱紅梅
（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.014.html

目的研究慢性不可預(yù)見(jiàn)刺激（chronically unpredictable stress，CUS）致大鼠抑郁行為與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（indole-2，3-dioxygenase，IDO）及3-羥氨苯甲酸雙加氧酶（3-hydroxyl amino acid oxygenase，HAAO）蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法♂Sprague Dawley（SD）大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS連續(xù)刺激28 d建立大鼠抑郁癥模型；以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠抑郁行為，以Western blot法檢測(cè)大鼠前腦皮層和海馬TNF-α、IDO及HAAO蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組大鼠相比，模型組被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分明顯降低（P＜0.01）、前腦皮層和海馬的TNF-α、IDO及HAAO蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論CUS誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁行為，其機(jī)制可能與激活腦內(nèi)TNF-α及下游IDO-HAAO通路有關(guān)。

抑郁癥；慢性不可預(yù)見(jiàn)刺激；腫瘤壞死因子α；吲哚胺2，3-雙加氧酶；3-羥氨苯甲酸雙加氧酶；細(xì)胞因子

抑郁癥是一種臨床常見(jiàn)的精神障礙性疾病，以少動(dòng)、思維緩慢、興趣缺失、記憶力減退等為主要特征，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)自殺傾向［1］。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、表觀遺傳學(xué)等眾多因素。研究顯示，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調(diào)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足、氧化應(yīng)激損傷等都與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)［2］。目前臨床常用的抗抑郁藥物如5-羥色胺（serotonin，5-HT）再攝取抑制劑、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）再攝取抑制劑等都是通過(guò)作用于單胺遞質(zhì)系統(tǒng)相應(yīng)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)突觸間隙遞質(zhì)水平而發(fā)揮治療作用，但這類機(jī)制很難解釋其藥物延遲性效應(yīng)。因此深入研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制，尋找藥物治療新靶點(diǎn)迫在眉睫。

最新研究顯示，抑郁癥與免疫激活和炎癥因子的釋放增加密切相關(guān)［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平明顯增高，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射脂多糖可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抑郁行為、TNF-α拮抗劑依那西普可明顯改善小鼠的抑郁行為［4-6］，提示免疫激活、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子釋放涉及抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。TNF-α是一種由多核巨細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在抑郁癥發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。TNF-α作為一種重要的促炎因子，可誘導(dǎo)IL、INF等其他促炎細(xì)胞因子的生成和釋放，引起炎癥的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是一種細(xì)胞內(nèi)的含亞鐵血紅素的酶，在催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝過(guò)程中起著限速酶的作用［7］。生理狀態(tài)下，IDO呈低水平表達(dá)，但在免疫激活、炎癥或感染過(guò)程中，細(xì)胞因子如TNF-α釋放增多，可誘導(dǎo)其明顯表達(dá)并過(guò)度激活，催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝，使合成5-HT的色氨酸耗竭，5-HT生成減少，誘發(fā)和（或）加重抑郁癥［8-9］。目前，最新臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果均顯示，IDO過(guò)表達(dá)和（或）活性增強(qiáng)與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，但不足以證明炎癥因子、IDO與抑郁癥之間的相互關(guān)系［10-11］。同時(shí)，IDO過(guò)度激活的犬尿氨酸途徑還可生成大量3-羥犬尿氨酸，并在3-羥氨苯甲酸雙加氧酶（3-hydroxyl amino acid oxygenase，HAAO）的作用下代謝生成喹啉酸，3-羥犬尿氨酸和喹啉酸均具有神經(jīng)毒性作用，也可能參與了抑郁癥的發(fā)生［12-13］。因此，本研究采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS建立大鼠抑郁模型，觀察大鼠前腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α及IDO、HAAO表達(dá)變化是否參與了抑郁癥的發(fā)生。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)♂Sprague Dawley（SD）大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0001。

1.2主要試劑與儀器BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；anti-TNF-α、anti-IDO、anti-HAAO抗體（英國(guó)Abcam公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；Sigma低溫高速離心機(jī)：德國(guó) Sigma公司（型號(hào)：3K30）；臺(tái)式離心機(jī)：上海市安亭科學(xué)儀器廠（型號(hào)：TGL-16C）；超低溫冰箱：日本Sanyo公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司（型號(hào)：170-1870）；Western blot垂直電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組和模型建立♂ SD大鼠30只，5 只/籠，自由飲水和攝食，在室溫（25±1）℃、通風(fēng)良好的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。對(duì)照組大鼠5只/籠，自由攝食飲水，不予刺激。模型組大鼠1只/籠，采用孤養(yǎng)結(jié)合CUS方式建立抑郁動(dòng)物模型。參照本實(shí)驗(yàn)室前期建模方法［14］，采用的刺激方式包括4℃冰水浴5 min，45℃熱水浴5 min，禁飲禁食24 h，潮濕墊料24 h，傾斜24 h，晝夜顛倒，電擊5 min，噪音3 h，閃頻3 h，水平振蕩10 min，夾尾1 min，共11種刺激，每天隨機(jī)給予1種刺激，連續(xù)刺激28 d，4 d內(nèi)同種刺激不重復(fù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不可預(yù)知。

1.3.2被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)（forced swim test，F(xiàn)ST）參考文獻(xiàn)［15］并加以改進(jìn)，測(cè)試時(shí)將大鼠放入高60 cm、直徑20 cm、水深30 cm的透明圓柱形玻璃缸內(nèi)，維持水溫（24±1）℃。測(cè)試時(shí)間7 min，記錄后5 min大鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

1.3.3曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open-field test，OFT）參照文獻(xiàn)［16］并加以改進(jìn)，采用內(nèi)壁為黑色的100 cm×100 cm×40 cm木質(zhì)敞箱進(jìn)行測(cè)定，木箱底部均分為25 個(gè)20 cm×20 cm的方格。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將大鼠置于木箱底部中央格，觀察并記錄5 min內(nèi)大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分（四爪均進(jìn)入的穿越格子數(shù)）和垂直運(yùn)動(dòng)得分（后肢直立次數(shù)）、理毛次數(shù)及大小便，將各項(xiàng)得分相加即為曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理糞便并用酒精清潔敞箱，以免大鼠遺留氣味對(duì)下次測(cè)試的影響。實(shí)驗(yàn)必須在安靜昏暗的環(huán)境下進(jìn)行。

1.3.4皮層和海馬TNF-α、IDO、HAAO蛋白表達(dá)測(cè)定末次刺激24 h后，每組取大鼠5只，4%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，于冰浴上分離前腦皮層和海馬并置于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)，將前腦

皮層和海馬組織取出并剪碎、碾磨、裂解、提取蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用Western blot方法檢測(cè)大鼠前腦皮層和海馬的的TNF-α、IDO、HAAO的蛋白表達(dá)。上樣量每孔30 μg，依次進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗 4℃孵育過(guò)夜，洗膜，二抗室溫下孵育（TNF-α、IDO 1 h，HAAO 25 min），洗膜（HAAO需室溫下孵育三抗35 min后再洗膜），ECL顯色，凝膠成像儀成像后，用Image Lab軟件（Bio-Rad）分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參校正蛋白表達(dá)。

2　結(jié)果

2.1CUS對(duì)大鼠行為的影響被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠被動(dòng)游泳不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），見(jiàn)Fig 1A。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)Fig 1B。提示CUS成功誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮、絕望等抑郁樣行為。

Fig 1　Effect of CUS on rat behaviors in FST and OFT（±s，n=15）

2.2CUS對(duì)大鼠前腦皮層和海馬TNF-α蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬TNF-α蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)Fig 2。提示CUS致大鼠產(chǎn)生抑郁行為時(shí)，炎癥因子TNF-α表達(dá)明顯升高。

Fig 2　Effect of CUS on TNF-α protein expression in rat brain（±s，n=5）

2.3CUS對(duì)大鼠前腦皮層和海馬IDO蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬IDO蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)Fig 3。提示CUS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠腦內(nèi)IDO表達(dá)明顯升高。

Fig 3　Effect of CUS on IDO protein expression in rat brain（±s，n=5）

2.4CUS對(duì)大鼠前腦皮層和海馬HAAO蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬HAAO蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)Fig 4。提示CUS抑郁大鼠腦內(nèi)HAAO表達(dá)明顯升高。

3　討論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及單胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能和HPA軸功能紊亂、氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)下降、免疫調(diào)節(jié)異常等多種病理生理學(xué)改變，但機(jī)制尚未完全闡明。動(dòng)物模型是研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥物的有效手段之一，其中CUS模型可模擬人在社會(huì)生活中遇到的各種不可預(yù)見(jiàn)刺激，是目前廣泛采用的動(dòng)物研究模型之一［17］。本研究采用CUS建立大鼠抑郁模型，研究抑郁癥的其他相關(guān)發(fā)病機(jī)制。FST和OFT是評(píng)價(jià)大鼠抑郁行為的有效指標(biāo)，F(xiàn)ST通過(guò)檢測(cè)大鼠在狹小環(huán)境的不動(dòng)時(shí)間，反映大鼠的絕望抑郁狀態(tài)；OFT通過(guò)檢測(cè)大鼠在新異環(huán)境中的探究行為，反映大鼠的焦慮抑郁狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分明顯降低，提示CUS誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)焦慮、絕望樣抑郁行為。

Fig 4　Effect of CUS on HAAO protein expression in rat brain（±s，n=5）

抑郁癥的“單胺遞質(zhì)假說(shuō)”和“細(xì)胞因子假說(shuō)”都是目前比較公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制。前者認(rèn)為突觸間隙的5-HT及NE水平低下是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)病的重要原因；后者認(rèn)為免疫激活、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子活化和釋放增多是抑郁癥發(fā)病的重要原因。Maes等［8］于2011年提出新的“5-HT假說(shuō)”，認(rèn)為免疫激活誘導(dǎo)IDO活化致色氨酸耗竭、5-HT合成不足及下游毒性代謝產(chǎn)物增加均參與了抑郁癥的發(fā)生。色氨酸是腦內(nèi)合成5-HT的前體物質(zhì)，主要通過(guò)兩條途徑進(jìn)行代謝，即色氨酸-5-HT通路和色氨酸-犬尿氨酸通路。色氨酸羥化酶是腦內(nèi)合成5-HT的限速酶，本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)，色氨酸羥化酶表達(dá)下調(diào)參與大鼠抑郁癥的發(fā)生［18］。IDO是肝臟以外唯一可催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝的限速酶。生理情況下，IDO呈低水平表達(dá)，但當(dāng)炎癥、感染等免疫激活時(shí)，細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ等的釋放可誘導(dǎo)IDO激活，催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝明顯增多，導(dǎo)致合成5-HT的前體物質(zhì)色氨酸耗竭，進(jìn)而致5-HT合成不足，參與抑郁癥的發(fā)生。Maes等［8］研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者細(xì)胞因子分泌明顯增多、IDO活性明顯增強(qiáng)；O'Connor等［5-6］發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、TNF等炎癥細(xì)胞因子可上調(diào)IDO表達(dá)誘導(dǎo)小鼠的抑郁樣行為，而應(yīng)用IDO拮抗劑1-MT可明顯抑制小鼠抑郁癥樣行為的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬TNF-α、IDO蛋白表達(dá)均明顯升高，提示CUS誘導(dǎo)大鼠抑郁行為與腦內(nèi)免疫激活和炎癥因子釋放并誘導(dǎo)IDO激活密切相關(guān)。與此同時(shí)，犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物也可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑中，犬尿氨酸可在犬尿氨酸羥化酶的作用下代謝為3-羥犬尿氨酸，后者在3-羥基犬尿氨酸酶作用下代謝為3-羥氨苯甲酸，最后在HAAO作用下最終代謝為喹啉酸。3-羥犬尿氨酸和喹啉酸都具有明顯的神經(jīng)毒性，前者可導(dǎo)致單胺氧化酶活性增強(qiáng)和氧自由基生成增多，加速單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝并加重機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷［19］；后者可作用于N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體，促進(jìn)谷氨酸釋放，發(fā)揮興奮毒作用［20］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬HAAO蛋白表達(dá)明顯升高，提示CUS誘導(dǎo)大鼠抑郁行為與腦內(nèi)HAAO過(guò)表達(dá)密切相關(guān)。

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TNF-α mediated activation of IDO pathway involved in mechanism of depression in rats induced by CUS

FU Xiao-yan，LI Hai-yan，CUI Ting，JIANG Qing-song，QIU Hong-mei
（Dept of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

AimTo investigate the relationship between the depression-like behaviors of rats induced by chronically unpredictable stress（CUS）and the protein expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α），indole-2，3-dioxygenase（IDO）and 3-hydroxyl amino acid oxygenase（HAAO）.MethodsThirty male Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into control group and model group.CUS plus solitary condition were used to establish the depression model.The open field test（OFT）and the force swimming test （FST）were used to evaluate the depression-like behaviors of rats；Western blot was used to determinethe protein expressions of TNF-α，IDO and HAAO in the prefrontal cortex and hippocampus of rats.Results Model group rats showed obvious depression-like behaviors with increasing immobile time in FST（P＜0.01）and decreasing locomotive activity in OFT（P＜0.01），and up-regulating the protein expression of TNF-α，IDO and HAAO in the prefrontal cortex and hippocampus significantly（P＜0.05），compared with control group rats.ConclusionThe depression-like behaviors of rats induced by CUS may be associated with the activation of IDO-HAAO pathway mediated by TNF-α.

depression；CUS；TNF-α；IDO；HAAO；cytokines

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.007

A

1001-1978（2016）05-0620-06

R-332；R322.81；R749.42；R977.3；R977.6

2015-12-26，

2016-01-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 31400881）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（No KJ1400208）

伏簫燕（1992-），女，碩士生，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：447811112@qq.com；邱紅梅（1978-），女，博士，副教授，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：qiuhongmei@cqmu.edu.cn