林燕文，陳妙英，毛露甜，陳兆貴

（惠州學院生命科學系，廣東　惠州　516007）

病蟲防治

馬鈴薯黑脛病菌的分離、純化及PCR檢測

林燕文，陳妙英，毛露甜，陳兆貴*

（惠州學院生命科學系，廣東惠州516007）

由Pectobacterium atroseptica引起的馬鈴薯黑脛病是影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要種薯傳播細菌病害，從種薯發(fā)芽到生長后期均可發(fā)病，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。為構建馬鈴薯黑脛病菌的分離、鑒定技術體系，從廣東省惠州市惠東縣大水坑馬鈴薯基地采集了疑似感染馬鈴薯黑脛病植株，對其進行病原菌分離和純化，得到7株病菌，利用引物Eca 1 g/Eca 2 g對其進行PCR擴增、將PCR產(chǎn)物測序并將所測定序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，使用Blast軟件進行比對確定目標菌株。結果表明，其中一株菌株能擴增出長度大約688 bp的特異性條帶，其DNA序列符合Eca 3762序列，鑒定為馬鈴薯黑脛病菌。此方法可以成功地從發(fā)病植株中分離出黑脛病菌，成本較低廉，為廣東省建立馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測和控制體系提供技術支撐。

馬鈴薯；黑脛病菌；馬鈴薯黑脛?。籆VP培養(yǎng)基；PCR檢測

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是茄科茄屬一年生雙子葉植物，起源于拉丁美洲安第斯山脈一帶，是世界四大糧食作物之一，在中國各地均有種植［1，2］。馬鈴薯黑脛病又稱黑腳病，是影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要種薯傳播細菌病害，帶菌種薯種植后，常造成非常大的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失［3，4］。馬鈴薯黑脛病是由Pectobacterium atroseptica誘發(fā)的，是一種革蘭氏染色呈陰性的致病菌［5］，該病菌主要侵染維管束組織，可侵染馬鈴薯的莖和塊莖，從種薯發(fā)芽到生長后期均可發(fā)病，以苗期最盛。廣東省因冬季氣溫適宜，近年冬種馬鈴薯發(fā)展迅速，但黑脛病造成爛種死苗，使馬鈴薯的品質(zhì)、產(chǎn)量等大幅降低，已成為制約廣東省冬種馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。本試驗開展馬鈴薯黑脛病菌分離與鑒定技術研究，為廣東省建立冬種馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測和控制技術體系奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1材料

疑似感染馬鈴薯黑脛病植株：采自廣東省惠州市惠東縣平海鎮(zhèn)大水坑馬鈴薯基地。革蘭氏染色陽性對照菌：蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）由惠州學院微生物室提供。

1.1.2試劑

牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂粉均為生物化學試劑，碘、碘化鉀、草酸銨、95%乙醇、番紅、香柏油、二甲苯、CaCl2·2H2O、硝酸鈉、聚果膠酸鈉、脫水檸檬酸三鈉、Tris、EDTA、SDS、蛋白酶K、CTAB、氯化鈉、氯仿、異丙醇、Taq酶、10×buffer、DNA marker DL2 000、dNTPs、6× Loading Buffer、GoldviewTMNucleic Acid Stain、Tris堿、硼酸、瓊脂糖等均為分析純或化學純，購自北京鼎國生物技術有限責任公司和大連寶生物工程有限公司。

1.1.3儀器

LDZX-40KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、FA1204B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）、TG16-W微量高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、DYY-12型電泳儀、WD-9413A凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠）、SW-CJ-1D型單人凈化工作臺（蘇州凈化）、SPX-350生化培養(yǎng)箱（北京科技有限公司）、563BR2605 My CyclerTMThermal Cycler（BIO RAD）、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）等。

1.1.4培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（按參考文獻［6］配制），CVP培養(yǎng)基（按參考文獻［7］配制），LB培養(yǎng)基：取LB培養(yǎng)基粉末21 g，加入1 L蒸餾水。

1.2試驗方法

1.2.1馬鈴薯黑脛病菌分離、純化和保存

（1）馬鈴薯黑脛病菌分離：取疑似感染馬鈴薯黑脛病菌植株的莖部（圖1），在離莖部發(fā)黑部分3 cm處，用滅菌剪刀剪取2 cm的馬鈴薯莖部，將其放入2%的次氯酸鈉水溶液中浸泡3 min，再用滅菌水沖洗2次，用滅菌濾紙將材料吸干。然后，用滅菌剪刀將剪取的馬鈴薯莖外部去除，再將剩余部分剪成2～3 mm的組織切片，放入滅菌研缽中，加入10 mL滅菌水研磨成組織液。最后，用移液槍吸取1 mL組織液加入盛有9 mL無菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液。再從其中用移液槍吸取1 mL溶液加入另一支盛有9 mL無菌水的試管中充分混勻，此為10-2稀釋液。以此類推制成10-3、10-4和10-5稀釋度的組織樣品液。用接種環(huán)蘸取組織樣品液在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上劃線，每種稀釋度設3個平行組，置于生化培養(yǎng)箱中，27℃培養(yǎng)2 d，挑取灰白色，圓形單菌落革蘭氏染色，染色后在10×100倍顯微鏡下觀察。

圖1　疑似感染黑脛病菌的植株莖部Figure 1　The stem suspected of being infected with P.atroseptica

（2）馬鈴薯黑脛病菌純化培養(yǎng)：挑取1.2.1（1）中革蘭氏染色為陰性短桿狀的單菌落，于CVP選擇性培養(yǎng)基平板上劃線，27℃培養(yǎng)2 d。再挑取培養(yǎng)基出現(xiàn)凹陷處的單菌落于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)2 d，再進行革蘭氏染色。顯微鏡下除了淡粉色的短桿菌外，如果還存在其他雜菌，則重新挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，直至純化無雜菌為止。

（3）馬鈴薯黑脛病菌保存：挑取CVP培養(yǎng)基凹陷處已純化的單菌落，在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上劃線，置生化培養(yǎng)箱中，27℃培養(yǎng)2 d后，2℃保存菌株。

1.2.2DNA的提取

取1.2.1（3）中獲得的疑似馬鈴薯黑脛病菌株，采用CTAB/NaCl法［1］提取馬鈴薯黑脛病菌DNA，每株菌株設置2個平行組。具體步驟如下：

（1）用接種環(huán)蘸取保存的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，27℃振蕩12 h。

（2）移取1.5 mL培養(yǎng)物于1.5 mL離心管中，在高速離心機中，12 000 r/min離心2 min。

（3）棄去上清液，向沉淀物加入567 μL TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮。

（4）加入30 μL 10%SDS溶液和3 μL 20 mg/mL蛋白酶K混勻，于37℃溫育1 h。

（5）加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻，再加入80 μL的10%CTAB/0.7 mol/L NaCl溶液混勻，于65℃溫育10 min。

（6）加等體積的氯仿/異戊醇（24:1）抽提。于10 000 r/min，離心5 min，將上清液轉入1只新離心管中。

（7）加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來（用冰浴放置40 min），10 000 r/ min，離心5 min。

（8）去上清液，用1 mL 70%乙醇進行清洗，10 000 r/min，離心5 min。

（9）棄掉乙醇，在超凈工作臺中干燥后，重新溶于50 μL TE緩沖液中。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴增

取1.2.2獲得的DNA作為模板，參考楊松［7］鑒定馬鈴薯黑脛病菌的方法，利用特異性引物Eca 1 g/Eca 2 g進行PCR檢測。

（1）引物序列、PCR反應條件、反應體系引物序列：Eca 1 g（5'GAAACCGTCACGCTGGATAAC3'）；Eca 2 g（3'AAGGTGTTGGGCAGATTGAGT5'）。PCR反應條件、反應體系分別見表1和表2。

（2）電泳檢測：制備凝膠：5×TBE溶液取10 mL，稀釋成50mL的1×TBE，取40mL的1×TBE置于錐形瓶中，向其加入0.4g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至65℃左右時加入2 μL的GoldviewTMNucleic Acid Stain，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置30 min左右，凝固后，輕輕拔出梳子，將鋪好膠的內(nèi)槽放入含有電泳緩沖液1×TBE的電泳槽中備用。

加樣：用移液槍分別取5 mL PCR擴增后的樣品溶液與1 μL 6×Loading Buffer一起混合均勻后加入加樣孔中。

電泳：蓋上電泳槽，接通電源，樣品端接負極，于99 V/mL電壓下電泳40 min，當溴酚藍快到達凝膠板下沿約1 cm處時，停止電泳。電泳結束后，即可在紫外燈下檢測結果。

1.2.4DNA序列測定

PCR產(chǎn)物交由大連寶生物工程有限公司進行純化測序。

表1　　PCR反應條件Table 1　PCR reaction condition

表2　　PCR反應體系Table 2　PCR reaction system

2　結果與分析

2.1馬鈴薯黑脛病菌的分離、純化結果

利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對馬鈴薯黑脛病菌進行分離，在培養(yǎng)基上觀察到菌落形態(tài)為圓形、乳白色，表面光滑濕潤、邊緣整齊、中間凸起（圖2）。

以革蘭氏染色陽性菌蘇云金桿菌為對照菌，將分離得到的病原菌進行革蘭氏染色，結果為淡粉色、呈陰性，短桿狀。將分離到的病原菌接于CVP選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后觀察到典型的凹坑。

2.2PCR擴增結果

利用引物Eca 1 g/Eca 2 g，以分離得到7株菌株DNA作為模板，進行PCR擴增，結果表明只有標號為1的菌株能擴增出大約688 bp的特異性條帶（圖3）。

2.3測序結果

將獲得的1號菌株PCR擴增產(chǎn)物交由大連寶生物工程有限公司進行測序，得到的測序結果如下：

CGCACGACATCCCTGCTCATCCCGACCACCGCAGGAACTG GTTCAGAAGCCACGCCGAATGCCATTCTGGCGATCCCGGAAAAA GAGACCAAGGTCGGCATTATTACGCCCGTGATGCTGCCGGACTA TGTTGCACTGGTGCCGGAGCTGACCATCAGCATGCCGCCACATA TTGCCGCCTCAACCGGTATCGACGCACTCTGCCACCTGATCGAG TGTTTCACCTCGACGATTGCCAACCCGGTCAGCGACAACTACGC GCTGATTGGCCTGAAGAAGCTGTTTGCCAACCTTGAAACGTCTG TGCGCGAACCGAGCAATCTGGAAGCCAAGCTGAATATGTTGTGG GCGTCCTATTACGGTGGTGCCGCCATTGCCCACTCCGGTACGCA TCTGGTTCACGCCATGTCTTACCCGCTAGGCGGTAAGTACCACA TCCCACACGGCGTCGCGAACGCCATCCTGCTCGCCCCTTGCATG CGCTTCGTGCAGGACGCTGCACAGGACAAATTCGCTCAGGCGTATGACCTGCTGCCGGATGCCGATCTAACGCTCGGTACCGCGGAA AAAGCGCAGGCGCTGGTGA

圖2　黑脛病菌菌落形態(tài)Figure 2　Colony morphology of P.atroseptica

圖3　引物Eca 1 g/Eca 2 g PCR擴增結果Figure 3　PCR amplification using the primer Eca 1 g/Eca 2 g

序列長688 bp。所測定序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，使用Blast程序在數(shù)據(jù)庫進行比對（圖4和圖5）。結果顯示，1號菌株PCR擴增的序列與編號為BX950851.1，CP003776.1，CP001657.1，CP001790.1和CP003415.1的5種基因序列同源性相似性分別達97%，93%，92%，91%和91%。經(jīng)比較鑒定后，1號菌株與編號為BX950851.1的Erwinia carotovora subsp.atroseptica相似性最為接近，表明1號菌株基本為馬鈴薯黑脛病菌。

3　討論

本試驗根據(jù)黑脛病的生物學性狀進行檢測，采用細菌分離、革蘭氏染色鑒定及CVP選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)等一系列過程初步獲得馬鈴薯黑脛病菌，此分離、純化菌種過程與前人稍有不同［5，7］。本試驗對分離到的菌種先進行革蘭氏染色，從中挑選淡粉色、陰性，短桿狀符合黑脛病菌特征的菌落接于CVP選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后觀察是否形成典型的凹坑，也能獲得良好試驗效果，而且能降低試驗成本。根據(jù)楊松［7］試驗結果可知，雖然實時定量熒光PCR檢測黑脛病菌靈敏度較常規(guī)PCR高，特異性也強，但其設備、耗材成本很高，故此方法更適合廣東種植馬鈴薯多個市縣開展黑脛病菌檢測，此方法對實驗室條件要求不高，但可靠性較強。

圖4　擴增片段的Blast鑒定結果Figure 4　Identification result of amplified fragment by Blast

圖5　擴增片段與P.atroseptica序列比較結果Figure 5　Result of sample sequence compared with P.atroseptica by Blast

測序結果1號菌株PCR擴增的序列與編號為BX950851.1 Eca的基因序列同源性達97%，其中3%的差異可能是1號菌株在擴增時堿基錯配，造成個別基因突變。另外，也可能是由于測序過程中所選擇的方法不同，對測序結果有一定程度的影響，因此造成比對差異。

廣東省因冬季氣溫適宜，獨具發(fā)展冬種馬鈴薯優(yōu)勢。在政府引導下，近年廣東冬種馬鈴薯發(fā)展迅速，全省多個市縣馬鈴薯種植面積逐年增加，馬鈴薯病害發(fā)生也逐年增加，由于目前條件所限，在廣東省種薯繁育還存在一定難度，馬鈴薯種薯主要從北方調(diào)種，調(diào)出區(qū)對種薯的質(zhì)量檢測管理不嚴，加之廣東省目前對種薯質(zhì)量的監(jiān)控幾乎處于空白，給馬鈴薯種植戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)廣東省冬種馬鈴薯種薯質(zhì)量的現(xiàn)狀，十分有必要開展馬鈴薯種薯的主要病原的分離與鑒定，為馬鈴薯種薯的質(zhì)量檢測提供技術支持。本研究結果對于馬鈴薯黑脛病防治工作、種薯黑脛病的檢測以及植物源抗黑脛病農(nóng)藥的研發(fā)具有重要意義。

［1］韓廣濤，楊志輝，朱杰華，等.雙重PCR技術檢測馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌方法的建立［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44（20）: 4199-4206.

［2］石立航，胡俊，蒙美蓮，等.華北地區(qū)馬鈴薯貯藏病害種類調(diào)查及病原菌鑒定［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學:自然科學版，2010（4）: 53-57.

［3］Deboer S H，Slack S A.Current status and prospects for detecting and controlling bacterial ring rot of potatoes in North America［J］. Plant Disease，1984，68（10）:841-844.

［4］Pérombelon M C M，Kelman A.Ecology of the soft rot Erwinias［J］. Annual Review of Phytopathology，1980，18（1）:361-387.

［5］董學志，胡林雙，魏琪，等.馬鈴薯黑脛病菌分離純化體系的建立［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2013（7）:45-48.

［6］沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.4版.北京:高等教育出版社，2007.

［7］楊松.馬鈴薯黑脛病菌實時定量熒光PCR檢測［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學，2009.

Isolation，Purification and PCR Detection of Pectobacterium atroseptica from Potato

LIN Yanwen，CHEN Miaoying，MAO Lutian，CHEN Zhaogui*
（Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou，Guangdong 516007，China）

ract:Potato black leg，caused by Pectobacterium atroseptica，is a major bacterial disease influencing potato production.It is spread by seed potato，and may occur in any stage from germination to late growth and seriously affect the yield and quality of potatoes.To establish a technical system which can isolate and identify P.atroseptica from potatoes，the samples suspected of being infected by the pathogen were collected from Dashuikeng of Huidong County in Huizhou City.Seven suspected bacterial objects were isolated and further purified.Their specific DNA fragments were amplified with primer Eca 1 g/Eca 2 g by PCR，and the fragments were sequenced and aligned with GenBank database.Finally，the bacterial objects were compared and determined by using Blast software.The results showed that a specified fragment about 688 bp was amplified in one of the objects，and its sequence matched that of Eca 3762.So it can be identified as P.atroseptica.This method could successfully isolate P.atroseptica from diseased potato plants with low cost，soit mayprovide atechnical support fortheseedpotatoquality detection andcontrolsystemof Guangdong Province.

rds:potato；Pectobacterium atroseptica；potato black leg；CVP culture medium；PCR detection

S532

A

1672－3635（2016）03-0169-06

2015-05-06

廣東省科技計劃項目“冬種馬鈴薯健康種薯質(zhì)量檢測和控制技術體系研究（2011B020303010）”，廣東省科技計劃項目“南方冬種馬鈴薯健康種薯繁育及高效栽植技術推廣應用（2013B090200023）”。

林燕文（1975-），女，高級實驗師，研究方向為農(nóng)業(yè)微生物學。

（Corresponding author）：陳兆貴，教授，研究方向為馬鈴薯種薯繁育及栽培技術，E-mail:Chenzg1973@126.com。