楊付紅，張春娣

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院)

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不同濃度普伐他汀對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

楊付紅1，張春娣2

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院)

目的觀察不同濃度普伐他汀對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法取A549細(xì)胞分為4組，分別加入含20、40、80、160 μmol/L普伐他汀的培養(yǎng)液，采用MTT法觀察各組培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖情況。取A549細(xì)胞分為3組，分別加入含普伐他汀40、80、160 μmol/L的培養(yǎng)液；另設(shè)空白對(duì)照組，僅加入培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果相同時(shí)間點(diǎn)不同濃度普伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率隨濃度升高逐漸升高(P均<0.05)；20、40、80、160 μmol/L普伐他汀作用48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率均高于同濃度作用24 h時(shí)(P均<0.05)。40、80、160 μmol/L普伐他汀作用48 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯升高(P均<0.05)，且隨濃度增加，凋亡率逐漸升高(P均<0.05)。隨著普伐他汀濃度增加，A549細(xì)胞Bax表達(dá)逐漸升高，Bcl-2表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)。結(jié)論普伐他汀對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，且隨濃度增加作用不斷增強(qiáng)；其機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

普伐他??；肺腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2

目前我國肺腺癌的發(fā)病率不斷增加，已成為肺癌最常見的病理類型[1]。他汀類是膽固醇合成的限速酶-羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可通過降低HMG-CoA還原酶活性，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成及阻滯羥甲基戊酸(MVA)途徑，從而抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化和凋亡[2，3]。最新研究顯示，他汀類藥物可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移等發(fā)揮抗腫瘤作用[4～6]。2015年1～12月，我們觀察了不同濃度普伐他汀對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用，及其對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax、Bcl-2的影響，探討其抗腫瘤作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料人肺腺癌A549細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。普伐他汀(美國Sigma公司)固體粉末50 mg，用雙蒸水配制成10 mmol/L的母液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.22 μm微孔濾器過濾除菌、分裝，-20 ℃避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要加入培養(yǎng)基稀釋。MTT(美國Sigma公司)，Bax、Bcl-2一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、AV-PI凋亡試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；酶標(biāo)儀(Labsystem MK3，芬蘭)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 μg/mL的F12培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶底的90%左右時(shí)，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液消化、傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖能力觀察采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為普伐他汀20、40、80、160 μmol/L組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入含20、40、80、160 μmol/L普伐他汀的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。另設(shè)空白對(duì)照組，僅加入培養(yǎng)液。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩均勻，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-觀察孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用PI染色法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于6孔板。將細(xì)胞分為普伐他汀40、80、160 μmol/L組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入含普伐他汀40、80、160 μmol/L的培養(yǎng)液。另設(shè)空白對(duì)照組，僅加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，常規(guī)消化，離心棄上清，PBS重懸細(xì)胞。再次離心，收集細(xì)胞，加入PBS重懸細(xì)胞。離心，棄PBS，加入適量Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC溶液和10 μL PI染料，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.5細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白檢測(cè)采用Western blot法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.4方法進(jìn)行分組、培養(yǎng)。48 h后加入PBS制成單細(xì)胞懸液，離心，加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。取蛋白行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉過夜，加入一抗Bax、Bcl-2和GAPDH內(nèi)參抗體，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)2 h，TBST洗膜，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影。以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的OD比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率比較相同時(shí)間點(diǎn)普伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率隨濃度升高而明顯升高；各濃度48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率均高于同濃度作用24 h時(shí)(P均<0.05)。見表1。

表1　各組細(xì)胞增殖抑制率比較±s)

注：與20 μmol/L組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，△P<0.05；與80 μmol/L組比較，▲P<0.05；與同一濃度24 h時(shí)比較，#P<0.05。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較40、80、160 μmol/L組及空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為4.270%±0.272%、8.423%±0.096%、12.440%±0.492%、1.380%±0.255%，普伐他汀各濃度組均高于空白對(duì)照組，80、160 μmol/L組高于40 μmol/L組，160 μmol/L組高于80 μmol/L組(P均<0.05)。

2.3各組細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較隨普伐他汀濃度升高，Bax蛋白表達(dá)逐漸升高，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)。見表2。

表2　各組細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，#P<0.05；與80 μmol/L組比較，△P<0.05。

3　討論

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的精確過程，通過細(xì)胞膜上的死亡受體激活Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，或通過胞質(zhì)內(nèi)線粒體中細(xì)胞色素C釋放激活Caspase-9，進(jìn)而活化Caspase-3促進(jìn)凋亡[7]。腫瘤細(xì)胞不受控制的異常增殖或細(xì)胞凋亡受到過度抑制，打破了細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的平衡關(guān)系，進(jìn)而誘發(fā)或促進(jìn)各種癌基因或相關(guān)信號(hào)途徑，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制往往造成腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控，因此促進(jìn)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤的重要途徑。細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子Bcl-2家族包括抗凋亡基因和促凋亡基因，其中Bcl-2可抑制各種刺激下多種細(xì)胞的凋亡，而Bax是重要的促細(xì)胞凋亡基因之一[8，9]。Bax可對(duì)抗Bcl-2的抗凋亡作用，又可以與Bcl-2形成異源二聚體Bcl-2/Bax，也可以與自身形成同源二聚體Bax/Bax，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax的比例在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，在正常情況下二者比值相對(duì)穩(wěn)定，而在凋亡信號(hào)的刺激下，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

他汀類藥物是一種有效地降低血清膽固醇藥物，具有除降脂作用外的多種功效，如減少心血管事件、抗炎、心肌保護(hù)等作用[10，11]。研究證實(shí)，他汀類藥物還可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移等發(fā)揮抗腫瘤作用。還有研究認(rèn)為，他汀類能夠誘導(dǎo)肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡[12]，對(duì)正常細(xì)胞沒有顯著毒性作用，具有良好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果顯示，20、40、80、160 μmol/L普伐他汀對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制率隨濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)而明顯升高；40、80、160 μmol/L普伐他汀作用48 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯升高；隨普伐他汀濃度增加，A549細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)逐漸升高，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低。提示普伐他汀可通過抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡過程中Bcl-2家族的作用來抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，而腫瘤細(xì)胞凋亡則是治療腫瘤的主要手段之一[13]。

綜上所述，普伐他汀可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，其作用隨普伐他汀濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在此過程中還伴有Bax蛋白表達(dá)增加和Bcl-2蛋白表達(dá)下降，證實(shí)普伐他汀可以呈濃度依賴性地促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1] 楊福堂,李燕,王淑云.色素上皮衍生因子對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].山東醫(yī)藥,2015,55(32):34-36.

[2] Hwang KE, Na KS, Park DS, et al. Apoptotic induction by simvastatin in human lung cancer A549 cells via Akt signaling dependent down-regulation of survivin[J]. Invest New Drugs, 2011,29(5):945-952.

[3] Qi XF, Zheng L, Lee KJ, et al. HMG-CoA reductase inhibitors induce apoptosis of lymphoma cells by promoting ROS generation and regulating Akt, Erk and p38 signals via suppression of mevalonate pathway[J]. Cell Death Dis,2013,4(2):e518．

[4] Spampanato C, Sarnataro M, Giordano E, et al. Simvastatin inhibits cancer cell growth by inducing apoptosis correlated to activation of Bax and down-regulation of Bcl-2 gene expression[J]. Int J Oncol, 2012,40(4):935-941.

[5] Kochuparambil ST, Al-Husein B, Goc A, et al. Anticancer efficacy of simvastatin on prostate cancer cells and tumor xenografts is associated with inhibition of Akt and reduced prostate- specific antigen expression[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2011,336(2):496-505.

[6] Thurnher M, Nussbaumer O, Gruenbacher G. Novel aspects of mevalonate pathway inhibitors as antitumor agents[J]. Clin Cancer Res, 2012,18(13):3524-3531.

[7] Hsuuw YD, Chan WH, Yu JS. Ochratoxin a inhibits mouse embryonic development by activating a mitochondrion-dependent apoptotic signaling pathway[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(1):935-953.

[8] Hao C, Gao L, Zhang Y, et al. Acetylated Chitosan Oligosaccharides Act as Antagonists against Glutamate-Induced PC12 Cell Death via Bcl-2/Bax Signal Pathway[J]. Mar Drugs, 2015,13(3):1267-1289.

[9] Karthikeyan S， Hoti SL，Prasad NR. Resveratrol loaded gelatin nanoparticles synergistically inhibits cell cycle progression and constitutive NF -kappaB activation，and induces apoptosis in non-small cell lung cancer cells[J]. Biomed Pharmacother, 2015,70(2):274-282.

[10] 馬樹人.較大劑量阿托伐他汀對(duì)擇期PCI術(shù)者心肌保護(hù)作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,30(6):90-904.

[11] 余陽陽,白峰,余靜,等.阿托伐他汀強(qiáng)化療法治療PCI術(shù)后急性冠脈綜合征患者的效果觀察[J].山東醫(yī)藥,2015,55(37):73-75.

[12] Osmak M. Statins and cancer: current and future prospects[J]. Cancer Lett, 2012,324(1):1-12.

[13] Jaganathan SK, Supriyanto E. Antiproliferative and molecular mech-anism of eugenol- induced apoptosis in cancer cells[J]. Molecules, 2012,17(6):6290-6304.

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新課題計(jì)劃基金(YJSCX20439Y)；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院博士基金(QY2015B-02)。

張春娣(E-mail: 260921464@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.012

R734.2

A

1002-266X(2016)22-0036-03

2015-12-02)