劉明麗，王金鳳，張東，陳良標(biāo)

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306）

鱗頭犬牙南極魚(yú)atp6v0c基因在HeLa細(xì)胞中抗寒功能的研究

劉明麗，王金鳳，張東，陳良標(biāo)

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306）

為探求南極魚(yú)ATP酶類在低溫適應(yīng)下的作用，從鱗頭犬牙南極魚(yú)Dissostichus mawsoni的cDNA文庫(kù)中克隆atp6v0c基因 （dmatp6v0c），并轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞在低溫脅迫下 （10℃）的死亡率，獲得了dmatp6v0c基因的全部編碼序列，其長(zhǎng)度為462 bp，并將其插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）上用于體外表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在低溫脅迫下，過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因的HeLa細(xì)胞死亡率從 （19.23±1.87）%顯著降低到（8.13±0.04）%（P＜0.05）。研究表明，在低溫脅迫下dmatp6v0c基因過(guò)表達(dá)能顯著降低HeLa細(xì)胞的死亡率，試驗(yàn)結(jié)果可為dmatp6v0c基因作為魚(yú)類耐寒育種的候選基因提供理論依據(jù)。

鱗頭犬牙南極魚(yú)；低溫脅迫；dmatp6v0c基因；Hela細(xì)胞；細(xì)胞死亡率

水體溫度直接影響魚(yú)類的生存，冬季的低溫會(huì)對(duì)熱帶魚(yú)類的養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，尋找關(guān)鍵基因用于改善熱帶魚(yú)類的耐寒性能成為解決這一問(wèn)題的有效手段，而作為生長(zhǎng)在極端低溫環(huán)境下的南極魚(yú)類，可為挖掘與寒冷相關(guān)的候選基因提供寶貴的研究材料［3］。

ATP6V0C（ATPase-H+transporting lysosomal vacuolar proton）是微囊 ATP酶 （V-ATPase）V0結(jié)構(gòu)域的c亞基［4-5］。V-ATPase是一種與細(xì)胞膜相關(guān)的多亞基蛋白復(fù)合體，也是受ATP驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵，可通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子［6-7］。V-ATPase包括V0和V1兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，V0結(jié)構(gòu)域由a、c、c′、c″、d和e 6個(gè)亞基組成，而V1結(jié)構(gòu)域由A、B、C、D、E、F、G和H 8個(gè)亞基組成［8］。V1結(jié)構(gòu)域的作用是水解ATP，而完整V0結(jié)構(gòu)域的作用是質(zhì)子的跨膜運(yùn)輸，利用V1結(jié)構(gòu)域水解ATP釋放的能量來(lái)驅(qū)動(dòng)質(zhì)子的跨膜運(yùn)輸［9］。V-ATPase位于許多真核細(xì)胞的多種細(xì)胞膜上，如溶酶體、核小體、高爾基體延伸出來(lái)的微囊和分泌泡［6］。在哺乳動(dòng)物中，V-ATPase的各亞基除了作為質(zhì)子泵的組成部分外，還有其他功能：V0結(jié)構(gòu)域的a亞基控制V-ATPase在細(xì)胞中的不同定位［9］，c亞基參與細(xì)胞間的交流［10］，e亞基在細(xì)胞融合過(guò)程中起作用［11］；V1結(jié)構(gòu)域的B和C亞基調(diào)控V-ATPase和 actin細(xì)胞骨架的功能，E亞基調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中Racl信號(hào)通路［12］。

研究表明，V-ATPase的功能主要是囊泡酸性環(huán)境的維持、囊泡和微囊的融合［13-14］、能量轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞pH的變化［15］等。而編碼V-ATPase V0結(jié)構(gòu)域c亞基的atp6v0c基因在魚(yú)類中扮演了不同的角色。Chung等［16］研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)atp6v0c的一種亞型atp6v0c2在神經(jīng)元中特異表達(dá)，參與神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的儲(chǔ)存和分泌，并調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)的神經(jīng)興奮。Chen等［3］通過(guò)對(duì)南極魚(yú)和熱帶魚(yú)類的轉(zhuǎn)錄組比較分析，表明與斑馬魚(yú)相比，鱗頭犬牙南極魚(yú)Dissostichus mawsoni的atp6v0c基因表達(dá)量顯著上升，暗示atp6v0c基因在極地魚(yú)類低溫適應(yīng)方面發(fā)揮了重要作用。本研究中，為探索南極魚(yú)dmatp6v0c基因在低溫適應(yīng)下的作用，從鱗頭犬牙南極魚(yú)Dissostichus mawsoni的cDNA文庫(kù)［3］中克隆了dmatp6v0c基因，并將其插入到真核表達(dá)載體中，用于在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)的高效表達(dá)，在低溫脅迫下，檢測(cè)過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因?qū)eLa細(xì)胞死亡率的影響，以此來(lái)評(píng)估dmatp6v0c基因的抗寒功能，旨在為體外快速選育與抗寒相關(guān)的候選基因提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用 Taq酶、DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ購(gòu)自NEB公司；pcDNA3.1（-）載體購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司；高溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Galaxy 170S）、低溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Galaxy170R）均購(gòu)自Eppendrof公司；培養(yǎng)基 DMEM ［含有青霉素（10 000 IU）和鏈霉素 （10 000 μg/mL）的混合液］、胰蛋白酶均購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；TurboFect購(gòu)自Thermo公司；其他常規(guī)試劑由省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1dmatp6v0c基因的克隆及真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)Dissostichus mawsoni cDNA文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果［3］，通過(guò)同源比對(duì)篩選得到dmatp6v0c編碼區(qū)基因序列。將dmatp6v0c編碼區(qū)基因序列和pcDNA3.1（-）上多個(gè)可用的酶切位點(diǎn)進(jìn)行序列比對(duì)后，選取pcDNA3.1（-）上的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)進(jìn)行基因插入。結(jié)合保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物序列為

Forward：5′CTGACTCGAGATGTCGGCCGAAAGTCCC 3′；

Reverse：5′CGTCGGATCCTTATTTCGTGGAGAGGATCAGG 3′（劃線部分為酶切位點(diǎn)）。

本研究中，從Dissostichus mawsoni cDNA文庫(kù)中PCR擴(kuò)增出該基因。將pcDNA3.1（-）載體和dmatp6v0c基因片段同時(shí)用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收，將膠回收后的基因片段用T4連接酶于16℃下連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于平板 （含100 μg/mL氨芐青霉素）上篩選。選取部分菌斑接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中以250 r/min培養(yǎng)13 h。用T7和BGH reverse通用引物對(duì)單克隆菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定。反應(yīng)體系 （共20 μL）：菌液1 μL，T7 primer 1 μL，BGH reverse primer 1 μL，dNTP 2 μL，10×reaction buffer 2 μL，Taq enzyme 0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件為：98℃下預(yù)變性5 min；98℃下變性10 s，55℃下退火5 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并對(duì)條帶進(jìn)行分析。陽(yáng)性菌液送生工生物工程 （上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并將送測(cè)的菌液保留備份。對(duì)測(cè)序成功的備份菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后嚴(yán)格按照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒保存于冰箱（-20℃）中，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

菌液PCR引物序列為

T7 promoter primer：5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′；

BGH reverse primer：5′TAGAAGGCACAGTCGAGGCT 3′。

試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，并且進(jìn)行PAGE純化。

1.2.2重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證 將pcDNA3.1（-）空載體和pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。酶切體系 （共50 μL）：DNA 1 μg，Xho Ⅰ1 μL，BamHⅠ1 μL，10×cut smart buffer 5 μL，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。37℃下酶切2 h，對(duì)酶切產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，驗(yàn)證其條帶大小。

1.2.3HeLa細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的HeLa細(xì)胞從液氮中取出，于37℃水浴中解凍，然后以1000 r/min離心5 min，去凍存液，迅速向凍存管中加入1 mL 37℃完全培養(yǎng)基 （90 mL DMEM高糖培養(yǎng)基加上10 mL FBS，使用前再加入1 mL雙抗），用移液器輕輕吹散細(xì)胞，將吹散的細(xì)胞連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移到直徑為100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并向平板中加入9 mL完全培養(yǎng)基，然后將平板置于37℃、5%CO2的高溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4轉(zhuǎn)染試驗(yàn)及低溫處理策略 轉(zhuǎn)染前將4× 105cells HeLa細(xì)胞接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24～48 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70% ～80%后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋15 μg質(zhì)粒至970 μL，混勻后加入30 μL TurboFect，于室溫中靜置20 min，然后分別加入到細(xì)胞密度適中的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)使轉(zhuǎn)染混合液均勻分布，然后置于高溫培養(yǎng)箱 （37℃）中培養(yǎng)2 d。轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質(zhì)粒的細(xì)胞作為試驗(yàn)組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1（-）空載體的細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞，然后將試驗(yàn)組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞分別在低溫培養(yǎng)箱 （10℃）中培養(yǎng)3 d。

1.2.5轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)鑒定清洗在10℃下培養(yǎng)3 d的試驗(yàn)組細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞，提取RNA，利用無(wú)RNase的DNase消化細(xì)胞RNA，然后嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系 （共20 μL）：模板1 μL，F(xiàn)orward引物1 μL，Reverse引物1 μL，dNTP 2 μL，10×reaction buffer 2 μL，Taq enzyme 0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性5 min；95℃下變性10 s，58℃下退火5 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析以及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.6細(xì)胞死亡率的檢測(cè) 熒光染料碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種可對(duì)細(xì)胞核染色的試劑，但不能透過(guò)活細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，這樣會(huì)讓PI穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色［17］。收集10℃下低溫處理3 d后的HeLa細(xì)胞，用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇對(duì)其進(jìn)行固定，4℃下過(guò)夜。用含5 μg/mL RNAase和20 μg/mL PI的PBS，在避光的室溫條件下處理細(xì)胞30 min，然后用流式細(xì)胞儀分別對(duì)染色后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞死亡率檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （mean±S.D.）表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1dmatp6v0c基因的克隆

本研究中，對(duì)Dissostichus mawsoni cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，然后與已知的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，獲得dmatp6v0c基因的編碼區(qū)序列，按此序列設(shè)計(jì)引物Forward/Reverse，并使用PCR方法擴(kuò)增出dmatp6v0c基因片段，經(jīng)測(cè)序表明，該基因的編碼區(qū)片段全長(zhǎng)為462 bp，其核苷酸序列和氨基酸序列如圖1所示。

圖1　dmatp6v0c基因編碼區(qū)序列和氨基酸序列Fig.1 Encoding sequence and amino acid sequence of dmatp6v0c gene

2.2dmatp6v0c基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

圖2　pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c示意圖Fig.2 Structure of pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c

為了使dmatp6v0c基因能夠在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，將其插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）上，插入位置如圖2所示。為了驗(yàn)證dmatp6v0c基因編碼區(qū)462 bp核苷酸序列是否成功插入到pcDNA3.1 （-）載體上，分別對(duì)pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質(zhì)粒和pcDNA3.1（-）空載體用XhoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)質(zhì)粒變成線性條帶，重組質(zhì)粒被切開(kāi)成2個(gè)條帶，一條大小為462 bp，另一條大小為5371 bp；而空載體只有一條可見(jiàn)帶，大小為5371 bp（圖3）。此結(jié)果表明，dmatp6v0c基因片段成功插入到pcDNA 3.1（-）載體上，形成重組質(zhì)粒，可進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

注：M為 DL5000 DNA Marker；A為雙酶切后的 pcDNA3.1 （-）-dmatp6v0c質(zhì)粒；P為雙酶切后的pcDNA3.1（-）空載體Note：M，DL5000 DNA Marker；A，pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c cut by double enzyme；P，pcDNA3.1（-）plasmid cut by double enzyme

2.3轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的鑒定

為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，本研究中分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組HeLa細(xì)胞的RNA進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄PCR。轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞作為試驗(yàn)組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1（-）空載體的HeLa細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，試驗(yàn)組的PCR產(chǎn)物大小為462 bp，而對(duì)照組未出現(xiàn)條帶 （圖4）。這表明dmatp6v0c基因在Hela細(xì)胞中成功地進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，可進(jìn)行細(xì)胞死亡率檢測(cè)試驗(yàn)。

圖4　HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果Fig.4 Gene transcription of overexpression of dmatp-6v0c gene in HeLa cell line

2.4HeLa細(xì)胞的死亡率

為了檢測(cè)低溫下HeLa細(xì)胞的死亡率，本研究中對(duì)經(jīng)低溫 （10℃）處理后的細(xì)胞進(jìn)行PI染色，然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。散點(diǎn)圖5-A中用橢圓形標(biāo)記的細(xì)胞群為PI陽(yáng)性細(xì)胞群，即為死亡細(xì)胞群；用長(zhǎng)方形標(biāo)記的細(xì)胞群為PI陰性細(xì)胞群，即為活細(xì)胞。通過(guò)統(tǒng)計(jì)PI陽(yáng)性細(xì)胞比率計(jì)算細(xì)胞的死亡率。從圖5-A可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組死亡細(xì)胞群中的細(xì)胞較少。試驗(yàn)組和對(duì)照組中的細(xì)胞死亡率如圖5-B所示，試驗(yàn)組HeLa細(xì)胞的死亡率為 （8.13±0.04）%，對(duì)照組為 （19.23±1.87）%，試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因可以減少低溫下HeLa細(xì)胞的死亡率。

圖5　過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因后HeLa細(xì)胞的死亡率Fig.5　Mortality of Hela cells in overexpression of dmatp6v0c gene

3 討論

魚(yú)類在低溫適應(yīng)過(guò)程中會(huì)通過(guò)增強(qiáng)氧化磷酸化，以提供足夠的能量維持身體的各項(xiàng)機(jī)能［18-19］。Coppe等［20］通過(guò)對(duì)生活在-1.86℃的南極冰魚(yú)Channichthyidae轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄組中124個(gè)候選的重復(fù)基因中有34個(gè)在線粒體中表達(dá)，其中ATP5S（ATP synthase，H+transporting，mitochondrial F0 complex，subunits）就是一種ATPase。ATP5S是一種ATP合成酶，它通過(guò)增強(qiáng)魚(yú)類線粒體中氧化磷酸化效率來(lái)增加ATP產(chǎn)生［21］。Belogru-dov［22］在動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)atp5s基因后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中線粒體內(nèi)膜的嵴增多增厚，而這種變化可以增加ATP合成體基片的交換速率；另外，過(guò)表達(dá)atp5s基因的細(xì)胞中細(xì)胞呼吸速率是普通細(xì)胞的2倍。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)atp5s基因能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞有氧呼吸來(lái)增加 ATP。除此之外，Gracey等［23］通過(guò)對(duì)低溫壓力下鯉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，結(jié)果也表明，低溫下通過(guò)氧化磷酸化途徑產(chǎn)生的ATP有增加的趨勢(shì)。與ATP合成酶相同，ATP6V0C也參與到氧化磷酸化的過(guò)程中，本試驗(yàn)中，HeLa細(xì)胞低溫下過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因能降低細(xì)胞的死亡率，這說(shuō)明在低溫下代償性的加強(qiáng)生物體氧化磷酸化的過(guò)程，能更多地提供ATP來(lái)維持機(jī)體的生理活動(dòng)。

低溫脅迫下，生物體中不僅ATP合成酶類表達(dá)量增加，而且其他ATP酶類的活性也會(huì)增強(qiáng)。例如P-ATPase，通過(guò)水解ATP產(chǎn)生的能量來(lái)運(yùn)輸各種離子。孔祥會(huì)等［24］通過(guò)測(cè)定鋸緣青蟹鰓中的P-ATPase活性，發(fā)現(xiàn)與在常溫下生活的鋸緣青蟹相比，低溫馴化后的鋸緣青蟹鰓中的P-ATPase （Na+，K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase）活性均隨著馴化溫度的降低而升高。另外，對(duì)南極魚(yú)和羅非魚(yú)的相關(guān)研究結(jié)果也支持這一結(jié)論［25-26］。低溫下生物體鰓的P-ATPase活性增強(qiáng)的作用是以水解ATP產(chǎn)生的能量來(lái)維持鰓的呼吸，以及運(yùn)輸離子來(lái)維持鰓的滲透壓平衡，從而保證體內(nèi)氧的供應(yīng)和基礎(chǔ)代謝的正常進(jìn)行［24］。ATP6V0C作為V-ATPase的V0結(jié)構(gòu)域的c亞基，它能通過(guò)水解ATP釋放能量驅(qū)動(dòng)溶酶體膜上的質(zhì)子泵將H+泵入溶酶體內(nèi)，從而形成并維持溶酶體的酸性環(huán)境。因?yàn)橹挥性谒嵝原h(huán)境條件下溶酶體才會(huì)與其他膜結(jié)構(gòu)融合，借此達(dá)到清除無(wú)用的生物大分子以及損傷和死亡細(xì)胞的目的［27-28］。低溫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的死亡細(xì)胞，可以通過(guò)這種方式予以清除［29］。筆者推測(cè)，低溫下dmatp6v0c基因的過(guò)表達(dá)能夠加速清理由于低溫脅迫而產(chǎn)生的死亡細(xì)胞，清理出這些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的物質(zhì)，能更好地維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究中首次通過(guò)在 HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因，發(fā)現(xiàn)該基因可以減少低溫脅迫下HeLa細(xì)胞的死亡率，表明在 HeLa細(xì)胞中dmatp6v0c基因具有抗寒的功能，本研究結(jié)果為dmatp6v0c基因成為提高生物體耐寒能力的功能基因提供了理論依據(jù)，同時(shí)提供了一種體外快速評(píng)估候選基因抗寒能力的方法。

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Cloning of atp6v0c gene from Antarctic notothenioid fish Dissostichus mawsoni and identification of its cold tolerance in HeLa cell

LIU Ming-li，WANG Jin-feng，ZHANG Dong，CHEN Liang-biao

（College of Fisheries and Life，Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The atp6v0c gene of Antaratic notothenioid fish Dissostichus mawsoni was cloned from Antarctic notothenioid fish cDNA library，and then transfected the dmatp6v0c gene obtained into the HeLa cell to detect cell viability under cold stress（10℃）by flow cytometry to investigate the ATPase responsive for the cold adaptation in Antarctic notothenioid fish.The complete coding sequence with 462 bp of dmatp6v0c gene was cloned and sequenced，and the dmatp6v0c coding sequence was inserted into the pcDNA3.1（-）vector by XhoI and BamHI restriction sites for gene expression in HeLa cell.The results showed that over-expression of dmatp6v0c gene in HeLa cell was found to reduce the cell mortality from 19.23%±1.87%to 8.13%±0.04% （P＜0.05）under cold stress compared with the control group.The findings indicated that the expression level of dmatp6v0c was heavily involved in cell viability under cold stress and that dmatp6v0c could be considered as a candidate for breeding cold resistant fish.

Dissostichus mawsoni；cold stress；dmatp6v0c gene；HeLa cell；cell mortality

Q291

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.002

2095-1388（2016）01-0007-06

2015-04-05

國(guó)家 “973”重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 （2010CB126304）；國(guó)家基金委重點(diǎn)項(xiàng)目 （31130049）；上海市一流學(xué)科水產(chǎn)基礎(chǔ)生物學(xué)項(xiàng)目

劉明麗 （1988—），女，碩士研究生。E-mail：mingli_2009@sina.com

陳良標(biāo) （1966—），男，博士，教授。E-mail：lbchen@shou.edu.cn