陶立,潘艷,李軍,許力干,韋志鋒,秦若甫,蘭美益,楊威,周慶安,陳澤祥(1.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧530001;2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧530001)

廣西首例牛肺炎支原體的分離和鑒定

陶立1,2,潘艷1,2,李軍1,2,許力干1,2,韋志鋒1,2,秦若甫1,2,蘭美益1,2,楊威1,2,周慶安1,2,陳澤祥1,2
(1.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧530001;2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧530001)

近幾年來廣西從外省引進(jìn)肉牛飼養(yǎng)的現(xiàn)象很普遍,因運(yùn)輸應(yīng)激因素誘發(fā)呼吸系統(tǒng)癥狀的疾病經(jīng)常發(fā)生,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕、咳嗽和呼吸困難,最終導(dǎo)致死亡.給養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失.為了弄清病因,2013年8月我們對桂林市某牛場出現(xiàn)的類似病例進(jìn)行了病原調(diào)查.該場原有存欄牛336頭,2013年7月11日從北方某省引進(jìn)肉犢牛93頭,到場后隔離觀察,第3天發(fā)現(xiàn)有牛出現(xiàn)喘氣,體溫升高.隨后多數(shù)牛也開始發(fā)病并出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難,臥地不起,拉稀或血樣糞便,部分牛最后因衰竭而死.曾用頭孢類抗生素治療無效,整個病程27頭牛發(fā)病,死亡7頭,發(fā)病率和病死率分別為29%(27/93)和25.9%(7/27).剖檢病死牛,病變局限在胸腔與肺部,肺尖葉、心葉和膈葉都表現(xiàn)出不同程度的紅色肉變,肺間質(zhì)增寬,還可見大小不等的黃白色壞死灶,氣管、支氣管里有大量的乳白色泡沫.胸腔有少量積液,心包積水,液體呈清亮黃色.其他臟器未見肉眼可見病理變化.經(jīng)對病原分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和病原特異性基因PCR檢測,鑒定該病病原為牛支原體.

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料病死牛肝、腎、肺、淋巴結(jié).

1.2試劑和儀器PPLO肉湯粉,購自杭州百思生物技術(shù)有限公司;瓊脂、TSA瓊脂、酵母,購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司;馬血清,購自廣東蕊特生物科技有限公司;青霉素,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;細(xì)菌微量生化鑒定管和藥敏試紙,購自杭州天和微生物試劑有限公司;微量DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司,DNA Marker2、PCR Taq Mix,購自廣東東盛生物科技有限公司;PCR儀,購自日本TaKaRa公司;凝膠成像系統(tǒng),購自美國Alpha Inotech公司.

1.3方法

1.3.1病原分離、形態(tài)觀察、細(xì)菌L型實(shí)驗(yàn)和生化性狀測定等均按石磊的方法[1]進(jìn)行.

1.3.2病原PCR鑒定按李大偉的方法[2]進(jìn)行病原的牛支原體特異性基因opp D/F的PCR鑒定,同時應(yīng)用牛傳染性胸膜肺炎特異性引物對樣品進(jìn)行鑒別診斷[1].將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體中,對獲得的克隆進(jìn)行鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序和分析.

1.3.3藥敏試驗(yàn)按秦若甫等[3]報道的方法進(jìn)行.

1.3.4其他細(xì)菌的分離無菌取病牛肝、腎、肺、淋巴結(jié)分別接種TSA瓊脂培養(yǎng)基和兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果.

2　結(jié)果

2.1病原的分離培養(yǎng)和菌落形態(tài)初次培養(yǎng)時,將肺組織勻漿后的上清液接種PPLO培養(yǎng)液后3 d,培養(yǎng)基顏色開始變?yōu)樽攸S色,繼續(xù)傳代培養(yǎng)時,培養(yǎng)基顏色變色時間縮短,在1～2 d,便可由紅色變?yōu)樽攸S,培養(yǎng)液顏色均一,透亮無混濁現(xiàn)象.固體培養(yǎng)基上,2～4 d便可見針尖大小的菌落生長,在4X10倍視野下觀察所有平皿均有典型的"煎蛋樣"菌落出現(xiàn),核心較厚,向下長入培養(yǎng)基中,周邊為一薄層的透明區(qū)(圖1).

2.2病原的染色形態(tài)觀察結(jié)果分離的病原革蘭染色不易著色,難以觀察;姬姆薩染色呈紫藍(lán)色,菌體呈現(xiàn)明顯的多形態(tài),多數(shù)呈球形,也有少數(shù)長短不一的桿狀或蝌蚪狀的菌體散在分布(圖2).

2.3病原生化性狀和細(xì)菌L型測定病原細(xì)菌L型測定無其他細(xì)菌形態(tài)出現(xiàn).生化試驗(yàn)結(jié)果表明,只能發(fā)酵乳糖,不能水解精氨酸,對葡萄糖、木糖、覃糖、七葉苷、蔗糖、尿素和甘露醇均不能分解利用.

2.4PCR鑒定利用牛支原體特異性基因op?p D/F F1和F2引物可以從樣品中擴(kuò)增出448 bp的片段,與預(yù)期相符,而應(yīng)用牛傳染性胸膜肺炎特異性引物擴(kuò)增樣品則為陰性(圖3).

圖1　病原菌落觀察(4X10)

圖2　病原姬姆薩染色觀察(10X100)

圖3　病原的PCR鑒定結(jié)果

2.5opp D/F基因序列測定與比較結(jié)果通過對病原的opp D/F基因的序列分析表明,病原(命名為Gxmboppdf)與國內(nèi)首次分離的牛支原體HB0801及Hubei-1株同源性為99.3%(圖4).

2.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)48 h培養(yǎng)后觀察,病原對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、左氟沙星、恩諾沙星、林霉素、氯霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、諾氟少星、大觀霉素、四環(huán)素高敏;對丁胺卡那霉素中敏;對阿奇霉素、紅霉素低敏;對頭孢拉定、青霉素、頭孢曲松、利福平、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑啉、氨芐西林、羅紅霉素、多粘菌素、復(fù)方新諾明耐藥.

2.7其他細(xì)菌的分離無菌取病牛肝、腎、肺、淋巴結(jié)分別接種TSA瓊脂培養(yǎng)基和兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h后未見有菌生長.

圖4　廣西牛支原體同源性比較及進(jìn)化樹分析

3　討論

根據(jù)發(fā)病經(jīng)過、臨床癥狀、病理變化、病原培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)、PCR鑒定,確診該病為牛支原體(Mycoplasma bovis)引起的犢牛肺炎,即傳染性牛支原體肺炎.自美國人Hale(1961)首次從患乳腺炎的牛奶中分離到該病原,目前已證實(shí)牛支原體可引發(fā)牛肺炎、乳腺炎,此外,還可導(dǎo)致角膜結(jié)膜炎、耳炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)和不孕等多種疾病,已在世界范圍內(nèi)存在.該病在歐洲最為嚴(yán)重,每年約有25%～33%的犢牛肺炎由牛支原體引起,經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1.44億～1.92億歐元[4-5].在美國每年由牛支原體引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病和乳腺疾病所造成的經(jīng)濟(jì)損失也高達(dá)1.40億美元,感染率高達(dá)70%[6].2008年,我國部分地區(qū)肉牛暴發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的犢牛肺炎疫情,辛九慶、石磊、冉智光等證實(shí)該疫情是由牛支原體引起的"傳染性牛支原體肺炎",疫情波及湖北、河南、山東、東北三省等多個省市自治區(qū),幾乎涵蓋了中國養(yǎng)牛的主要產(chǎn)區(qū),牛發(fā)病率高達(dá)50%～ 100%,病死率達(dá)10%～50%,給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,7-8].廣西是飼養(yǎng)水牛最多的省(區(qū)),存欄437萬頭,奶牛存欄8.77萬頭,最近幾年肉牛產(chǎn)業(yè)也蓬勃興起,引種和流通增多,以肺炎癥狀為主的病例時有發(fā)生,不易治療,給養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失.在臨床診斷中,牛支原體引起的臨床癥狀和病理剖檢變化與牛傳染性胸膜肺炎類似,造成診斷上的困難,因此病原分離與鑒定成為最終確診的重要依據(jù).本實(shí)驗(yàn)室在收集到牛肺臟病料時進(jìn)行了病原的分離和鑒定,結(jié)果分離到1株牛支原體.此前,廣西未見有牛支原體病的報道,本文首次報道了廣西從外地引進(jìn)的肉牛有該病的存在,但本病在廣西的流行情況以及對廣西養(yǎng)牛業(yè)造成危害程度有待進(jìn)一步調(diào)查.

目前尚無商品化的疫苗對牛支原體病進(jìn)行預(yù)防,臨床上宜采取綜合性的防治措施.一是加強(qiáng)對牛群的引種檢疫,不從疫區(qū)引種,引種前應(yīng)做好牛支原體病、結(jié)核、布魯菌病、泰勒蟲病等檢測,防止引進(jìn)病牛或帶菌牛.牛群引回后應(yīng)隔離檢疫,確保牛群健康并做必要的預(yù)防接種和驅(qū)蟲后方可混群;二是加強(qiáng)對牛群的飼養(yǎng)管理和消毒工作;三是對發(fā)病牛隔離治療,早發(fā)現(xiàn),早診斷,早治療是有效控制本病的原則.在用藥上宜全群(和病牛接觸的牛群)用藥,療程要夠,藥量要足.藥敏試驗(yàn)的結(jié)果表明,四環(huán)素類、喹諾酮類和泰樂菌素類對牛支原體敏感,但要注意經(jīng)常變換藥物,以免耐藥性的產(chǎn)生而使治療效果不理想.

[1]石磊.牛支原體肺炎病原的鑒定、診斷和疫苗的初步研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[2]李大偉.牛支原體PCR診斷方法的建立及流行病學(xué)調(diào)查[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[3]秦若甫,李智紅,韋志鋒,等.二株綿羊肺炎支原體藥物敏感性試驗(yàn)和臨床治療體會[J].廣西畜牧獸醫(yī),2011,27 (3):165-166.

[4]Nicholas R A J,Ayling R D.Mycoplasma bovis:disease,diag?nosis,and control[J].Reasearch in Veterinary Science,2003, 74:105-112.

[5]Hale H H,Helmboldt C F,Plastridge W N,et al.Bovine mastitis caused by Mycoplasma species[J].Comell vet,1962,52:582-591.

[6]Caswell J L,Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle[J].Anim Health Res Rev,2008,8(2):161-186.

[7]辛九慶,李媛,郭丹,等.國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008,30(9):661-664.

[8]冉智光,謝建華,駱璐,等.我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2010,32(1): 40-43.

S852.65+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

0529-6005(2016)02-0046-02

2014-02-31

廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)(14-045-31-A-6);廣西科研基本業(yè)務(wù)費(fèi)桂科專項(xiàng)(15-3)

陶立(1964-),男,高級獸醫(yī)師,本科,從事動物疫病的防制和研究工作,E-mail:gxlitao1223@163.com

陳澤祥,E-mail:xjszexiang@163.com