王建超,張培軍,張東鳴,盧玉婷,巴翠玉,李月紅(.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長春308;.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心,吉林長春30000)

不同組合芽孢桿菌對鯉魚免疫功能的影響

王建超1,張培軍2,張東鳴1,盧玉婷1,巴翠玉1,李月紅1
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長春130118;2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心,吉林長春130000)

為了研究不同組合芽孢桿菌對鯉魚免疫功能的影響,將240尾鯉魚隨機分為4組:對照組(基礎(chǔ)日糧)、試驗組I(添加枯草芽孢桿菌)、試驗組II(添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)、試驗組III(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌).結(jié)果顯示,與對照組相比,試驗組II鯉魚白細(xì)胞吞噬百分比提高顯著,達20.2%(P<0.05),而白細(xì)胞吞噬指數(shù)提高顯著達41.5%(P<0.05),血清中免疫球蛋白M(IgM)提高顯著達26.1%(P<0.05),血清中溶菌酶活性提高顯著達21.9%(P<0.05),腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量提高顯著達53%(P<0.05),淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高顯著達32%(P<0.05);試驗組I鯉魚腸黏膜免疫球蛋白A(SIgA)含量比對照組提高顯著達92%(P<0.05).表明飼糧中添加芽孢桿菌在鯉魚的免疫性能方面具有一定的增強作用,其中混合的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在鯉魚的特異性和非特異性免疫機能方面的提高更為顯著.

芽孢桿菌;鯉魚;白細(xì)胞吞噬活性;魚免疫球蛋白;溶菌酶;淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

益生菌是一種綠色、安全、高效的抗生素替代物,具有改善水生動物腸道微生態(tài)環(huán)境、分泌消化酶、提高飼料轉(zhuǎn)化率、預(yù)防疾病、促進生長作用以及降低水體中有毒有害物質(zhì)含量,改善養(yǎng)殖水質(zhì)等功能[1].

目前,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中益生菌的使用常采用單一菌群微生態(tài)制劑和不同菌群的復(fù)合微生態(tài)制劑,常用菌種包括:芽孢桿菌、乳酸菌、酵母、光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌等.其中芽孢桿菌具有較強的產(chǎn)胞外酶的能力,能提高動物免疫能力,具有穩(wěn)定性好、抗性強、復(fù)活率高等優(yōu)點,在養(yǎng)殖及飼料中的研究應(yīng)用較多[2].已有研究表明[3-4],在水產(chǎn)飼料中添加芽抱桿菌,可以抑制腸道內(nèi)有害菌的繁殖,促進腸道有益菌生長,維持動物腸道的菌群平衡,同時可以提高動物的消化酶活性,增強機體免疫功能.枯草芽孢桿菌主要通過提高機體非特異性免疫來增強機體的免疫防御機能.地衣芽孢桿菌主要促進免疫器官胸腺和脾臟的發(fā)育和成熟,提高魚類免疫功能[5].蠟樣芽孢桿菌是由健康動物體內(nèi)分離得到的菌株,該菌對多種動物無毒無害,可調(diào)節(jié)動物胃腸道的微生態(tài)平衡,對防治動物腹瀉、促進動物健康生長具有重要作用[6].

當(dāng)前研究菌種主要集中在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌單一菌種的飼喂添加比較,而枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌之間組合飼喂在水產(chǎn)動物中研究應(yīng)用則較少.因此,本試驗以當(dāng)年鯉魚作為試驗對象,比較研究基礎(chǔ)飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌3種不同芽孢桿菌組合對鯉魚的生長和機體免疫功能的影響,為芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗動物鯉魚240尾,均質(zhì)量57.42±0.58 g,鯉魚由長春市新立城水庫提供.

1.2主要試劑枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)研究室保存.免疫球蛋白M(IgM)和腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)測定試劑盒,購自上海朗頓生物科技有限公司.血清溶菌酶測定試劑盒,購自南京建成生物工程研究所.淋巴細(xì)胞分離液,購自天津市瀕洋生物制品科技有限責(zé)任公司.MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒,購自碧云天生物技術(shù)研究所.

1.3試驗設(shè)計試驗鯉魚,經(jīng)兩周馴化飼養(yǎng)后,選擇適應(yīng)環(huán)境、體格健壯的鯉魚隨機分4個處理組,每個處理組3個重復(fù),每個重復(fù)20條魚.試驗I、II組和III組基礎(chǔ)日糧中,添加的芽孢桿菌使其最終含菌量為1X105CFU/g,再加混合菌種時等比例添加,保持最終的含菌量一致.試驗開始后每天8:00、12:00和19:00 3次投喂,按鯉魚體重的3%日投餌量飼喂.3 d換1次水,換總水量的1/3,水應(yīng)充分曝氣.試驗期間水溫保持在25℃±3℃.

1.3.1金黃色葡萄球菌吞噬原的制備將金黃色葡萄球菌接種到液體LB培養(yǎng)基中置于28℃,180 r/min條件下震蕩培養(yǎng),24 h后,加入終體積3%福爾馬林滅活,繼續(xù)28℃培養(yǎng)48 h.涂板驗證是否滅活后,用無菌生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)稀釋到1X108cells/mL,4℃保存?zhèn)溆?

1.4測定指標(biāo)及方法

1.4.1樣品采集與處理飼養(yǎng)結(jié)束禁食24 h后.采用心臟取血和尾靜脈取血,將每尾魚的血液分成3份:1份置冰箱內(nèi)4℃過夜,第2天2 000 r/min離心15 min,分離血清,血清置于-20℃保存待測.1份血液置于EDTA抗凝管中保存待測.最后1份血液置于肝素抗凝管中保存待測,供測定白細(xì)胞吞噬活性.在冰上解剖取鯉魚腸段約5 cm并稱重,用剪刀破開腸腔放入裝有PBS(0.01 mol/L,pH值=7.4)的離心管中.8 000 r/min(4℃)離心30 min后,收集上清作為腸洗液樣品,-20℃保存?zhèn)溆?

1.4.2白細(xì)胞吞噬活性測定向0.2 mL抗凝血中加入0.05 mL金黃色葡萄球菌吞噬原,充分混勻后置于25℃水浴鍋中水浴60 min,水浴期間每隔10 min搖勻1次,然后以1 000 r/min離心5 min,吸取白細(xì)胞層制作涂片.每個血樣涂片3張.待片上水分臨近全干.用Wight-Giemsa染液混合染色,油鏡下觀察計數(shù).并按下式計算吞噬百分比(Phagocytic percentage,PP)和吞噬指數(shù)(Phagocyt?ic index,PI).

吞噬百分比(pp)=(100個白細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100)X100%;吞噬指數(shù)(PI)=被吞噬的細(xì)菌數(shù)/吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù).

1.4.3血清指標(biāo)檢測免疫球蛋白(IgM)的測定使用ELISA試劑盒(Fish IgM ELISA KIT).血清溶菌酶活性測定,用空白對照法測定溶菌酶并按其說明書進行操作.

1.4.4小腸黏膜SIgA含量測定取上述腸洗液,以Fish SIgA ELISA試劑盒檢測單位質(zhì)量小腸內(nèi)含有的SIgA量.

1.4.5外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定MTT法測定外周血T淋巴細(xì)胞增殖,淋巴細(xì)胞分離方法參照試劑盒說明書.以刺激指數(shù)(Stimulation Index, SI)來表示淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率[7].

刺激指數(shù)(SI)=試驗孔OD均值/對照孔OD均值.

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件單因子方差分析,鄧肯氏進行多重比較;統(tǒng)計結(jié)果所有數(shù)據(jù)均以平均值表示,顯著水平P<0.05.

2　試驗結(jié)果

2.1對鯉魚白細(xì)胞吞噬活性影響從圖1和圖2可見,添加不同組合的芽孢桿菌,試驗組I鯉魚的白細(xì)胞吞噬活性百分比(PP%)和吞噬指數(shù)(PI)與對照組相比分別提高了6%和15%,差異均不顯著(P>0.05).試驗組III鯉魚的白細(xì)胞吞噬活性百分比(PP%)和吞噬指數(shù)(PI)與對照組相比分別提高了2%和14%,差異均不顯著(P> 0.05).試驗組II鯉魚白細(xì)胞吞噬活性百分比(PP%)和吞噬指數(shù)(PI)與對照組相比分別提高了20.2%和41.5%,差異均顯著(P<0.05).

圖1　鯉魚血液白細(xì)胞吞噬百分比(PP%)

圖2　鯉魚血液白細(xì)胞吞噬指數(shù)(PI)

2.2對鯉魚免疫球蛋白M(IgM)的影響從圖3可見,添加不同組合的芽孢桿菌后,試驗組I和試驗組III鯉魚血清中的免疫球蛋白M(IgM)與對照組相比分別提高了2%和1%,差異均不顯著(P> 0.05).試驗組II鯉魚血清中的免疫球蛋白M (IgM)比對照組提高了26.1%,差異顯著(P< 0.05).

2.3對鯉魚血清溶菌酶活性的影響從圖4可見,添加不同組合的芽孢桿菌后,試驗組I和試驗組III血清中的溶菌酶活性與對照組相比分別提高了6%和7%,差異均不顯著(P>0.05).試驗組II鯉魚血清中的溶菌酶活性比對照組提高了21.9%,差異顯著(P<0.05).

圖3　鯉魚免疫球蛋白M含量對比

圖4　鯉魚血清的菌酶活性(μg/mL)

2.4對鯉魚腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的影響從圖5可見,投喂不同組合芽孢桿菌后,試驗組III鯉魚腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)比對照組提高了8%,差異不顯著(P>0.05).試驗組I和試驗組II鯉魚腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)與對照組相比分別提高了92%和53%,差異顯著(P<0.05).

圖5　鯉魚腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)

2.5對鯉魚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響從圖6可見,投喂不同組合芽孢桿菌后,試驗組I和試驗組III鯉魚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(刺激指數(shù)SI)與對照組相比分別提高了6%和8%,差異均不顯著(P> 0.05).試驗組II鯉魚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(刺激指數(shù)SI)比對照組提高了32%,差異顯著(P<0.05).

圖6　鯉魚刺激指數(shù)(SI)

3　討論

吞噬細(xì)胞的吞噬作用是魚類最重要的非特異性免疫反應(yīng)[8].因此,測定魚類吞噬細(xì)胞的活性對于準(zhǔn)確評價魚類的免疫功能是極為重要的[9].本試驗結(jié)果表明,投喂芽孢桿菌的試驗組的白細(xì)胞吞噬活性高于對照組,但是在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組合的試驗組II顯著高于對照組(P< 0.05).本試驗與Rajesh[10-11]等研究發(fā)現(xiàn),露斯塔野鯪投喂芽孢桿菌后白細(xì)胞吞噬活性顯著提高試驗結(jié)果一致.溶菌酶作為魚類的非特異性免疫(先天性免疫)物質(zhì)之一,在魚體抵抗感染性致病菌的最前沿防御機制中起著重要作用.本試驗選擇測定鯉魚血清的溶菌酶活性,試驗組I、II和III溶菌酶活性高于對照組,且試驗組II溶菌酶活性顯著高于對照組(P<0.05).試驗表明,投喂枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組合菌可顯著提高鯉魚的溶菌酶活性.張強等[12](2010)研究表明,芽孢桿菌顯著提高了鯽魚的溶菌酶活性與本試驗結(jié)果相一致.魚類的特異性免疫球蛋白M(IgM)在投喂不同組合芽孢桿菌后,試驗組II的免疫球蛋白M(IgM)顯著高于對照組(P<0.05).試驗表明,枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組合對鯉魚的特異性體液免疫有顯著提高作用.特異性腸黏膜分泌型IgA在腸道黏膜表面形成重要的免疫保護層,是腸道免疫屏障的主要效應(yīng)因子.在投喂不同組合的芽孢桿菌后,試驗組I和II顯著高于對照組(P<0.05),但是試驗組I比對照組顯著提高了92%,而試驗組II比對照組顯著提高了32%,說明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組合對鯉魚的腸黏膜免疫影響更顯著.

淋巴細(xì)胞主要參與特異性免疫反應(yīng),在免疫應(yīng)答中起核心作用[13].在哺乳動物中參與特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞主要有兩類,即T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞.T細(xì)胞在特異性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用,不僅負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫,對B細(xì)胞參與的體液免疫起輔助和調(diào)節(jié)的作用.細(xì)胞免疫是由T細(xì)胞介導(dǎo)的機體另一種重要的免疫反應(yīng),通常以其轉(zhuǎn)化率的高低來衡量.彭小云等[14]研究表明,給草魚喂益生菌,其胸腺和脾T淋巴細(xì)胞增殖功能明顯高于對照組,表明益生菌能夠增強機體的細(xì)胞免疫功能,并能極顯著提高血液中T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P<0.05).本試驗結(jié)果表明,試驗組I淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組(P<0.05).試驗組II中枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的組合對鯉魚的免疫功能方面有增強作用,提高鯉魚的免疫功能.

綜上,飼料中添加不同組合的芽孢桿菌可在一定程度上改善鯉魚的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能.其中以枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組合對鯉魚的免疫功能的提高最為顯著.試驗結(jié)果為不同組合芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用提供理論依據(jù).

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Effects of different combinations of Bacillus on carp immune function

WANG Jian-chao1,ZHANG Pei-jun2,ZHANG Dong-ming1,LU Yu-ting1,BA Cui-yu1,LI Yue-hong1
(1.Animal Science and Technology College,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China; 2.Jilin Province Health Surveillance Inspection Center,Changchun 130000,China)

In this study,we investigated the effect of different combinations of Bacillus on carp immune function.Two hundred and forty fish were random ly divided into four groups:control group(basal diet),the experimental group I(add B.subtilis),the ex?perimental group II(add Bacillus subtilis and Bacillus),the experimental group III(Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis and Ba?cillus cereus).Our results showed that compared with the control group,the experimental group II carp phagocytic percentage was significantly increased up to 20.2%(P<0.05),the phagocytic index was significantly increased up to 41.5%(P<0.05),serum immu?noglobulin M(IgM)was significantly increased up to 26.1%(P<0.05),serum lysozyme activity was significantly increased up to 21.9%(P<0.05),intestinal mucosal secretory immunoglobulin a(SIgA)content was significantly increased up to 53%(P<0.05)and lymphocyte transformation rate was significantly increased up to 32%(P<0.05).Test group I carp Intestinal mucosal immunoglobu?lin A(SIgA)in test group I carp was significantly increased by 92%when compared with the control group(P<0.05).Our results in?dicate that dietary Bacillus plays a certain role in enhancing the performance of the carp immune response,wherein the m ixing of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis works better in enhancing the specific and non-specific aspects of immune function.

Bacillus;Carp;Phagocytic activity of leucocytes;Immunoglobulin;Lysozyme;Lymphocyte transformation rate

LI Yue-hong

S942.1

A

0529-6005(2016)02-0110-04

2015-03-23

國家自然科學(xué)基金(30972191)(30671621);農(nóng)業(yè)部948項目(2014Z34);長春市農(nóng)業(yè)先進實用技術(shù)的示范推廣項目(2013193)

王建超(1988-),女,碩士生,研究方向為動物疾病與免疫,E-mail:1244823777@qq.com

李月紅,E-mail:liyhong@sina.com