顏友榮,方向紅,王琳琳(江蘇省農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州225300)

蘇中地區(qū)豬大腸桿菌的耐藥性與耐藥基因的試驗

顏友榮,方向紅,王琳琳
(江蘇省農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州225300)

為分析蘇中地區(qū)豬大腸桿菌的血清型、耐藥譜和毒力基因的關(guān)系,從蘇中地區(qū)豬相關(guān)病料中分離出已定型的145株E.coli,其中O9、O45、O107和O139為優(yōu)勢血清型.采用瓊脂稀釋法測定其對14種抗菌藥的敏感性,通過多重PCR方法檢測耐藥性最嚴重的氨基糖苷類和四環(huán)素類各4種毒力相關(guān)基因.結(jié)果顯示,幾乎所有菌株對氟苯尼考、多西環(huán)素和四環(huán)素高度耐藥,而對頭孢曲松高度敏感,其中多重耐藥菌株多數(shù)耐5種以上藥物,常見的多重耐藥表型是氟苯尼考/氯霉素/多西環(huán)素/四環(huán)素/氨芐西林.PCR鑒定結(jié)果表明,含有毒力基因的菌株中38%至少具有兩個毒力基因,其中EAST1+Stx2e和hlyF+Stx2e比較常見.比較常見的毒力基因為Stx2e和EAST1,STb基因僅在一株菌中檢測到.

大腸桿菌;耐藥性;毒力基因;耐藥圖譜

大腸桿菌病是一種重要的人畜共患病,該菌通常緊密粘附于腸上皮細胞的表面或嵌入腸上皮細胞表面的凹陷中,使黏膜呈特征性損傷,局部微絨毛萎縮,腸黏膜壞死,進而形成潰瘍[1].根據(jù)毒力特征和所致疾病癥狀的不同,至少可分為3種類型,產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)、志賀毒素大腸桿菌(STEC)和粘附與脫落性大腸埃希菌(AEEC).ETEC主要通過其表面的粘附素,如K88、K99、987P和F41等粘附于小腸上皮細胞,隨后分泌熱敏腸毒素(LT)或耐熱腸毒素.

1　材料與方法

1.1菌株來源145株試驗大腸桿菌來自于蘇中地區(qū)獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場、動物醫(yī)院疑似大腸桿菌感染的病死豬,無菌采集其有明顯病變的肝、心、脾、肺等病料.經(jīng)分離培養(yǎng)和鑒定,實驗室保存?zhèn)溆?

1.2試驗材料試驗藥物:阿莫西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、壯觀霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、甲氧芐氨嘧啶、安普霉素.

1.3藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI 2010版)的指導原則和執(zhí)行標準.

1.4判定標準以CLSI文件為指導原則,以敏感、中介、耐藥3種形式對MIC值做出判定.同時檢測其多重耐藥性.

1.5毒力基因與耐藥性的關(guān)系根據(jù)藥敏試驗結(jié)果調(diào)查蘇中地區(qū)豬大腸桿菌中針對耐藥性較普遍抗生素的耐藥基因情況,找出其規(guī)律并研究毒力基因與耐藥性的關(guān)系.由于本試驗中蘇中地區(qū)豬大腸桿菌對氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物的耐藥率較高,因此,采用多重PCR方法檢測4種氨基糖苷類耐藥基因aad A1、aa C2、aac4、aph A3[1]和3種四環(huán)素類耐藥基因tet A、tet C以及tet M的流行情況.

2　結(jié)果

2.1145株豬源致病性大腸桿菌的藥敏試驗測定結(jié)果大腸桿菌是引起仔豬的腹瀉性死亡的最常見的因素,而臨床上對豬大腸桿菌病的治療通常采用的方法是用抗生素.因此,本試驗對14種常見藥物的耐藥性進行了檢測(見表1和表2),結(jié)果表明,絕大部分的菌株對頭孢唑啉和頭孢噻肟敏感.而耐藥性最高的是四環(huán)素類和氨基糖苷類.耐藥性均達到了70%以上.

表1　145株豬大腸桿菌對14種抗菌藥物的MIC值范圍及MIC50和MIC90

表2　145株豬大腸桿菌的多重耐藥率

表3　8種耐藥基因的檢測結(jié)果

2.2多重耐藥性檢測結(jié)果從表3可以看出,大腸桿菌的所有分離株中都表現(xiàn)不同程度的多重耐藥性,至少有3耐,最多的14耐.在這些菌中10耐、11耐、12耐菌株居多,分別為15.86%、19.31%、22.07%, 8耐和9耐菌株占分離株的11.03%、9.66%.

2.3豬源大腸桿菌的耐藥基因檢測結(jié)果所有定型血清型中,O9、O45、O107和O139為優(yōu)勢血清型,所有優(yōu)勢血清型對氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物耐藥,其中O9血清型菌株的耐藥性呈6-13耐,且87%以上對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和氯霉素耐藥;而73%以上的菌株對安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感.PCR擴增結(jié)果顯示,所有O9血清型菌株均含有aad A1、tet M基因,60%的菌株擁有Stx2e和53%的菌株擁有eae A和sta基因, 40%的含有F4基因.O45血清型菌株呈4-13耐,其中所有菌株對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素和四環(huán)素耐藥,但對頭孢唑啉和頭孢噻肟敏感.攜帶的毒力基因主要有:ast A(82%)、Stx2(e82%)、eae A(45%)和sta(45%).

經(jīng)PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析,aad A 1 26.7%、aa C 2 10.0%、aa C 4 0.0%、aph A 3 0.0%、aa?d A 1/aa C 4 6.7%、aad A 1/aph A 3 0.0%、aa C 2/aa C 4 3.3%、aad A 1/aa C 2 33.3%、aad A 1/aa C 2/aph 3 0.0%、aad A 1/aa C 4/aph 3 3.3%、aad A 1/aa C 2/aa C 4 3.3%、aad A 1/aaC 2/aa C 4/aph 3 3.3%;tet A 10.0%、tet C 20.0%、tet M 6.7%、te A/tet C 3.3%、tet A/ tet M 10.0%、tet C/tet M 10.0%、te A/tet C/tet M 6.7%.

3　討論

甲氧芐氨嘧啶較敏感是由于他在蘇中地區(qū)的獸醫(yī)臨床上使用的時間較短的緣故.而敏感菌株大多數(shù)來自于管理模式較為落后的養(yǎng)殖場.

氨基糖苷類藥物耐藥機制有3種,分別是降低藥物吸收或降低藥物在細胞膜的通透性;改變核糖體的結(jié)合位點;產(chǎn)生藥物功能集團滅活酶.第3種是氨基糖苷類藥物耐藥的普遍機制,細菌能產(chǎn)生50多種分別編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶、腺苷轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因[2].

除了四環(huán)素的廣泛應(yīng)用之外,位于接合質(zhì)?；蚪雍限D(zhuǎn)座子上四環(huán)素耐藥基因的轉(zhuǎn)移也是耐藥性產(chǎn)生的主要原因之一[3].通過調(diào)查發(fā)現(xiàn),本研究中的大腸桿菌中有96.7%的四環(huán)素耐藥菌株攜帶tet A基因,這與國外的某些報道一致,Kim等擴增了2000-2005年間從韓國分離到的致病性大腸桿菌中的tet (A)和tet(B)基因,結(jié)果分別有78.4%和13.7%的菌株這兩種耐藥基因的克隆結(jié)果為陽性[4].此外,Bryan等對從美國的人和各種動物體內(nèi)分離的大腸桿菌進行了四環(huán)素耐藥基因攜帶情況的調(diào)查,結(jié)果也表明,tet(A)和tet(B)為最主要的四環(huán)素耐藥基因(攜帶率分別為35%和63%)[5].

tet(M)基因在對四環(huán)素耐藥的革蘭陽性菌中多見,而在革蘭陰性菌尤其是大腸桿菌中的研究資料則相對較少.2004年Bryan等首次報道從雞和豬體內(nèi)分離的大腸桿菌中克隆到了tet(M)基因[5],2006年Jones等首次證實了人臨床大腸桿菌分離株中tet (M)基因的存在[6],但在國內(nèi)目前尚未見大腸桿菌攜帶tet(M)基因的文獻報道.在本試驗中,28%的大腸桿菌耐藥菌株攜帶有tet(M)基因,并且這些菌株還同時攜帶有tet(A)基因,其原因可能與tet(M)位于結(jié)合轉(zhuǎn)座子上,而結(jié)合轉(zhuǎn)座子可以轉(zhuǎn)座多個四環(huán)素耐藥基因有關(guān)[6].另外,在本試驗中沒有檢測到單個的只攜帶tet(M)基因的耐藥菌株,因此tet(M)基因在大腸桿菌對四環(huán)素耐藥機制方面的作用需進一步深入的研究.

[1]張安云,王紅寧,周萬蓉,等.用四重PCR方法檢測野生動物分離細菌對氨基糖苷類藥物的耐藥基因[C].中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第12次學術(shù)研討會論文集.井岡山:中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會,2007:1087-1090.

[2]George A M.Multidrug resistance in enteric and other Granr nega?tive bacteria[J].FEMS Microbiology Letters,1996,139(1):1-10.

[3]Roberts M C.Update on acquired tetracycline resistance genes[J]. FEMS Microbiology Letters,2005,245(2):195-203.

[4]Kim T E,Jeong Y W,Cho S H,et al.Chronological study of anti?biotic resistances and their relevant genes in Korean avian patho?genic Escherichia coli isolates[J].Journal of Clinical Microbiolo?gy,2007,45(10):3309-3315.

[5]Bryan A,Shapir N,Sadowsky M J.Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse,nonselected, and nonclinical Escherichia coil strains isolated from diverse hu?man and animal sources[J].App lied and Environmental Microbiol?ogy,2004,70(4):2503-2507.

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S852.61

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0529-6005(2016)02-0090-02

2014-04-29

顏友榮(1978-),男,副教授,碩士,從事豬大腸桿菌的研究,E-mail:38539187@qq.com