黃娟,任穎超,張玉鳳,單虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266109)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒新結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF5a分子特征

黃娟,任穎超,張玉鳳,單虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266109)

本研究采用RT-PCR方法從臨床病料中擴(kuò)增得到了5株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)山東流行株新結(jié)構(gòu)蛋白ORF5a基因序列,并與國(guó)內(nèi)外其他22株P(guān)RRSV ORF5a基因序列進(jìn)行了比較和分析.結(jié)果表明,5株P(guān)RRSV山東株ORF5a基因CDS為141 bp,編碼46個(gè)氨基酸,序列同源性為93.6%～100%(nt)和89.4%～100%(aa);5株山東株與其他Ⅱ型PRRSV同源性為83.0%～99.3%(nt)和72.3%～100%(aa).在ORF5a蛋白上高度保守的R/Q基序區(qū),LX13 (3)株有3個(gè)氨基酸的變異,CY13株有1個(gè)氨基酸的變異.與2006年以前的毒株相比,我國(guó)2006年以后分離的毒株第8、12、28位和42位的氨基酸發(fā)生了變異.進(jìn)化樹(shù)分析表明,5株P(guān)RRSV山東株與高致病性PRRSV代表株JXA1株在同一個(gè)亞群.

豬繁殖與呼吸綜合征病毒;結(jié)構(gòu)蛋白;ORF5a基因;序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)于1987年首次發(fā)現(xiàn),我國(guó)1996年首次分離到其病原PRRSV, 2006年出現(xiàn)高致病性PRRSV變異株[1].目前該病尚無(wú)有效治療藥物,免疫接種也不能完全保護(hù)[2].目前,PRRSV的毒力、致病機(jī)理及保護(hù)性免疫的機(jī)制都還缺乏詳細(xì)的闡述,制約了新型疫苗的研制及PRRS的有效防控.

PRRSV為動(dòng)脈炎病毒屬成員,根據(jù)基因和抗原差異性可分為歐洲型(Ⅰ型,代表株LV)和美洲型(Ⅱ型,代表株VR-2332).2011年在動(dòng)脈炎病毒中發(fā)現(xiàn)存在嵌合基因ORF5a,該基因起始于ORF5上游第10 nt處,編碼43 aa～64 aa,其中,PRRSV ORF5a蛋白氨基酸序列歐洲型(Ⅰ型)為43 aa,美洲型(Ⅱ型)為46 aa或51 aa[3].ORF5a基因和GP5蛋白基因部分重疊,可能由同一個(gè)亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄[3]. ORF5a蛋白預(yù)測(cè)為Ⅰ型膜蛋白,帶有一個(gè)短外膜區(qū),單一轉(zhuǎn)膜區(qū)和一個(gè)含8 aa的高度保守的R/Q基序的內(nèi)膜尾巴[3],反常的是,這個(gè)保守的R/Q基序編碼區(qū)核苷酸序列與GP5外膜區(qū)高度變異的糖基化位點(diǎn)序列相同,該糖基化位點(diǎn)與中和抗體及病毒免疫逃避有關(guān)[4],因此,這一區(qū)域極有可能與PRRSV免疫有關(guān);用PRRSV VR-2332感染豬,可于第4周檢測(cè)到血清中的ORF5a蛋白特異性抗體,第6周該抗體達(dá)到峰值,說(shuō)明ORF5a蛋白參與PRRSV的體液免疫反應(yīng)[5].ORF5a蛋白與病毒生存活力也有關(guān)系,突變ORF5a基因序列會(huì)使PRRSV感染性克隆失去活性[6].

目前,關(guān)于PRRSV ORF5a基因文獻(xiàn)報(bào)道較少,為了了解該基因分子特征,我們從臨床疑似PRRS病料中擴(kuò)增得到了ORF5a編碼區(qū),并進(jìn)行了基因克隆、序列測(cè)定和分析,以期為了解PRRSV ORF5a基因變異特點(diǎn)、防控該病提供有價(jià)值的信息.

1　材料與方法

1.1病料采集2013年送檢疑似PRRS病豬的肺臟、淋巴結(jié),置-70℃保存?zhèn)溆?

1.2主要試劑宿主菌E.coli DH5α、克隆載體pMDT19、oligodT、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker和DNA膠回收試劑盒,均購(gòu)自TaKaRa公司;MMLV為Promega公司產(chǎn)品;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Ⅱ型,購(gòu)自美國(guó)Omega公司;TRIZol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品.

1.3引物上游引物:5′-CCATTCTGTTGGCAATT TGA-3′,下游引物:5′-GGCATATATCATCACTG?GCG-3′,預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物大小為716 bp,擴(kuò)增片段包括ORF5和ORF5a.引物送由TaKaRa公司合成.

1.4病料處理與總RNA提取取50～100 mg組織病料,加入1 mL TRIZol試劑,搗碎勻漿后按TRIZol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA.

1.5RT-PCR用M-MLV和Oligo d(T)反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA.取2 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng):94℃3 min; 94℃45 s;58℃45 s;72℃60 s,共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min.

1.6PCR產(chǎn)物克隆與測(cè)序回收1.0%瓊脂糖凝膠中的目的片段,并與pMDT19連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后,用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后PCR鑒定陽(yáng)性克隆.

1.7ORF5a基因序列分析將陽(yáng)性質(zhì)粒送往北京賽百盛基因技術(shù)有限公司測(cè)序,用DNAStar MegAlign軟件對(duì)山東流行株和22株參比毒株ORF5a核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析,繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增與克隆從5份送檢病料中均擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的核酸片段(圖1),分別命名為HD13,LX13(1),LX13(2),LX13(3)和CY13.

圖1　PRRSV山東株ORF5a基因RT-PCR擴(kuò)增

2.2ORF5a基因核苷酸序列同源性分析5株P(guān)RRSV山東株ORF5a基因CDS均為141 bp,核苷酸序列同源性為93.6%～100%.與LV(M96262)的相似性為59.8%～60.6%,與VR-2332(AY150564)及其他參考毒株的核苷酸序列相似性在83.0%～ 99.3%之間.

2.3ORF5a氨基酸序列分析

2.3.1ORF5a氨基酸序列同源性比較5株P(guān)RRSV山東株的ORF5a基因均編碼46個(gè)氨基酸,推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.4%～100%.與LV的相似性為47.7%～52.3%,與VR-2332及其他參考毒株的氨基酸序列相似性在72.3%～100%.

2.3.2ORF5a氨基酸變異分析ORF5a蛋白第32～39位R/Q基序上,分離株CY13在34位發(fā)生了氨基酸的突變(R→Q),LX13(3)在35～37位都發(fā)生了突變(Q→R,Q→P,Q→P).另外,我國(guó)2006年以后分離的毒株第8、12、28位和42位的氨基酸都發(fā)生了變化(見(jiàn)中插彩版圖2).

2.4ORF5a進(jìn)化樹(shù)分析根據(jù)ORF5a基因進(jìn)化樹(shù),Ⅱ型毒株可劃分為3個(gè)亞群,5株山東株同JXA1和HuN4等高致病性變異株在同一亞群,VR-2332和BJ-4等經(jīng)典毒株在同一亞群,CH-1a和CH-1R等可歸為過(guò)渡亞群(圖3).本研究的5株P(guān)RRSVORF5a的氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系同核苷酸序列的進(jìn)化關(guān)系具有相似性(圖4),說(shuō)明CY13和LX13(3)在R/Q基序上的氨基酸突變沒(méi)有改變其亞群分布.

圖3　ORF5a基因核苷酸序列遺傳演化分析

圖4　ORF5a基因氨基酸序列遺傳演化分析

3　討論

目前關(guān)于PRRSV ORF5a的文獻(xiàn)報(bào)道較少,我們之前在對(duì)PRRSV的RNA干擾研究中發(fā)現(xiàn),靶向ORF5a基因和ORF5基因重疊區(qū)的shRNA比單純靶向ORF5基因的shRNA更能有效抑制PRRSV復(fù)制[7],說(shuō)明ORF5a在PRRSV復(fù)制中具有重要作用,但具體機(jī)制尚不清楚.Han等[8]將JXA-1傳至第80代,在ORF5a內(nèi)部ORF5之前有4個(gè)氨基酸的插入,表明5a蛋白胞外區(qū)的長(zhǎng)度改變不影響5a蛋白的功能.本文克隆了5株P(guān)RRSV山東株ORF5a基因,結(jié)果表明其CDS均為141 bp,編碼46個(gè)氨基酸,屬于Ⅱ型PRRSV高致病性毒株.氨基酸比較表明我國(guó)2006年以后分離的毒株第8、12、28位和42位的氨基酸與2006年以前的毒株相比都發(fā)生了變化,提示這些位點(diǎn)的氨基酸可能與PRRSV的致病性有關(guān).

以CH-1a株為代表的PRRSV亞群Ⅱ和以JXA1株為代表的PRRSV亞群ⅢORF5a都包含46個(gè)氨基酸,相比之下,以VR-2332株和BJ-4為代表的PRRSV亞群Ⅰ的的ORF5a蛋白包含51個(gè)氨基酸,由此可以推測(cè),ORF5a蛋白C端的5個(gè)氨基酸的差異(QLDAM)并未對(duì)PRRSV產(chǎn)生生物學(xué)或系統(tǒng)發(fā)育上的影響,但其他潛在的作用還未得知.ORF5a蛋白C端有一個(gè)高度保守的富含谷氨酰胺和精氨酸的R/Q基序,認(rèn)為能與RNA結(jié)合高效調(diào)節(jié)mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)與包裝[9].本研究中分離株CY13在R/Q基序34位發(fā)生了氨基酸的突變(R→Q),LX13(3)在35～37位都發(fā)生了突變(Q→R,Q→P,Q→P),由此猜測(cè),該保守的R/Q基序元發(fā)生的突變也許與不同毒株致病力的高低存在一定關(guān)系.Ⅰ型PRRSV和其他動(dòng)脈炎病毒R/Q基序保守性不是那么顯著[3],R/Q基序的高度保守性,以及與GP5高度易變的糖基化位點(diǎn)重疊,導(dǎo)致了Ⅱ型PRRSV的毒力較強(qiáng)[10].對(duì)ORF5a基因序列進(jìn)行分析,有助于進(jìn)一步研究該區(qū)域變異性對(duì)病毒復(fù)制及致病性的影響.

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Sequence Analysis of ORF5a,a New Structural Protein Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

HUANG Juan,REN Ying-chao,ZHANG Yu-feng,SHAN Hu
(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Universities of Shandong,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

ORF5a gene sequences of five PRRSV strains were obtained from Shandong Provinces by RT-PCR and sequenc?ing.ORF5a gene variation of the 5 isolates and other 22 published PRRSV isolates was analyzed.The results showed that the 141 bp ORF5a gene of 5 isolates shared 93.6%～100%nucleotid(nt)and 89.4%～100%amino acid(aa)identity with each other, while have 83.0%～99.3%(nt)and 72.3%～100%(aa)homology with those published strains(typeⅡPRRSV).mutations muta?tions occurred in strain LX13(3)at R/Q motif,for strain CY13,and 1 mutation was found in the strain CY13.Compared with strains isolated before 2006,amino-acid mutations at position 8,12,28 and 42 were observed.Phylogenetic analysis suggested that the 5 isolates belonged to the same subgroup with JXA1,the representative strain of highly pathogenic PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;structural protein;ORF5a gene;sequence analysis

SHAN Hu

S852.65+1

A

0529-6005(2016)02-0012-03

2014-11-21

國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)(2012FY111000);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè);青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金(6630719);青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校工程大學(xué)生科研創(chuàng)新立項(xiàng)

黃娟(1977-),女,副教授,博士,研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病防制,E-mail:happyhj888@163.com

任穎超(1989-),女,碩士,研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病防制, E-mail:sdzbryc@163.com

注:任穎超與黃娟對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

單虎,E-mail:shanhu67@163.com