米俊憲,張磊,皇甫和平,葉曉敏(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,河南鄭州450046)

血清錳含量測(cè)定方法的改進(jìn)

米俊憲,張磊,皇甫和平,葉曉敏
(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,河南鄭州450046)

為了達(dá)到簡(jiǎn)化操作流程、縮短檢測(cè)時(shí)間的目的,本試驗(yàn)從樣品的前處理、甲醛肟試劑添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等方面對(duì)國(guó)標(biāo)測(cè)定水中錳含量的方法作出改進(jìn).試驗(yàn)結(jié)果表明,采用干濕結(jié)合法對(duì)血清進(jìn)行前處理可縮短處理時(shí)間,減少鹽酸揮發(fā)給人體帶來的傷害;甲醛肟試劑最佳添加量為3 mL,最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min;最低檢測(cè)限達(dá)5 μg/L.改進(jìn)后的檢測(cè)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,值得推廣應(yīng)用.

血清錳;測(cè)定;分光光度法

錳是動(dòng)物所必需的微量元素,大量研究表明,錳在動(dòng)物機(jī)體中有重要營(yíng)養(yǎng)作用,它是精氨酸激酶、丙酮酸梭化酶的重要組成部分,也是部分激酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶等的激活劑,具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力和提高動(dòng)物繁殖性能等作用[1],對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的副作用也較小[2].因此,有必要對(duì)動(dòng)物體內(nèi)錳的含量進(jìn)行測(cè)定研究,并最終在生產(chǎn)中更準(zhǔn)確、更科學(xué)地評(píng)價(jià)動(dòng)物的錳營(yíng)養(yǎng)狀況并滿足其錳營(yíng)養(yǎng)需要,從而最終達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物健康、高效生產(chǎn)的目的.而現(xiàn)有的測(cè)定方法或者需要繁雜的樣品預(yù)處理[3],或者干擾因素多,或者靈敏度低,或者設(shè)備儀器昂貴[4]故而設(shè)計(jì)了本試驗(yàn).本試驗(yàn)針對(duì)國(guó)標(biāo)測(cè)定水中錳含量的方法(GBT 8538-2008-4.16)作出改進(jìn),以達(dá)到簡(jiǎn)化操作流程、縮短檢測(cè)時(shí)間的目的.并用此方法來檢測(cè)血清中錳含量,與原子吸收光譜法測(cè)定結(jié)果比較,判定其準(zhǔn)確性[5].

1　材料與方法

1.1試劑硫酸亞鐵銨溶液:稱取70 mg硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O],加入10 mL硫酸溶液(1+ 9),用去離子水稀釋至1 000 m L;氫氧化鈉溶液(160 g/L):稱取160 g氫氧化鈉(NaOH),溶于去離子水,并稀釋至1 000 mL;甲醛肟試劑:稱取10 g鹽酸羥胺(NH2OH.HCL)溶于50 mL去離子水中,加入5 mL甲醛溶液(p20=1.08 g/ml),用去離子水水稀釋至100 mL,將試劑保存在陰涼處,至少可保存1個(gè)月;EDTA-Na2溶液(372 g/L):稱取37.2 g EDTANa2,加入約50 mL氫氧化鈉溶液攪拌至完全溶解,用純水稀釋至100 mL;氨水溶液(35+100):量取70 mL氨水(p20=0.88 g/mL),用去離子水稀釋至200 mL;鹽酸羥胺溶液:稱取41.7 g鹽酸羥胺(NH2OH.HCL),溶于去離子水并稀釋至200 mL;氨性鹽酸羥胺溶液:將氨水溶液和鹽酸羥胺溶液等體積混合即成;錳標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(1 mg/mL):稱取1.2912 g氧化錳(MnO,優(yōu)級(jí)純),加硝酸溶液(1+1)溶解后,用純水定容至1 000 mL,搖勻備用;錳標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(10 μg/mL):吸取5.0 mL錳標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液,用純水定容至500 mL.

1.2試驗(yàn)器材722N型分光光度計(jì)(由蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn));FA2004型電子天平(上海精密儀器廠生產(chǎn));SX2-4-10型馬福爐(由天津天有利科技有限公司生產(chǎn));水浴鍋.

1.3不同甲醛肟試劑添加量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

取150 mL錐形瓶6個(gè),各加入50.0 mL錳標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和1.0 mL硫酸亞鐵胺溶液,再分別加入0.5 m L、1.0 m L、1.5 m L、2.0 m L、2.5 m L、3.0 m L甲醛肟試劑,混勻.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氫氧化鈉溶液,混勻后靜置10 min.再加入3 mL氨性鹽酸羥胺溶液,至少放置1 h,于450 nm波長(zhǎng)下,用1 cm比色皿以純水為參比,測(cè)定各溶液的吸光度[3].

1.4不同反應(yīng)溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響取150 m L錐形瓶8個(gè),各加入50.0 m L錳標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和1.0 mL硫酸亞鐵胺溶液,再加入1.0 mL甲醛肟試劑,混勻.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氫氧化鈉溶液,混勻后靜置10 min.再加入3 mL氨性鹽酸羥胺溶液,將溶液混勻后分別置于室溫、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴鍋中,1 h后取出冷卻,于450 nm波長(zhǎng)下,用1 cm比色皿以純水為參比,測(cè)定各溶液的吸光度.

1.5不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響操作方法同1.4,室溫下每隔10 min于450 nm波長(zhǎng)下,用1 cm比色皿以純水為參比,測(cè)定各溶液的吸光度.

1.6不同前處理對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響將待測(cè)樣品(健康成年犬血清)采用下列不同處理方法,測(cè)定其錳含量,并作比較[6].

不作處理:將采集靜脈血分離得到的血清直接進(jìn)行測(cè)定.

干消化法:取樣品于坩堝中,加1 mL硝酸,待黃煙消逝后,移入馬福爐200℃炭化2 h,然后將溫度升至500℃,繼續(xù)炭化6 h,冷卻,取出加0.12 mL硝酸溶樣,轉(zhuǎn)入10 mL比色管,定容.

濕消化法:取樣品于50 mL比色管,加濃硝酸2 m L,少頃冒黃煙,待試樣近溶解,置于馬福爐上消解,消化液呈淺黃色,加雙氧水3～5滴,反復(fù)幾次,直至樣品呈無色透明.轉(zhuǎn)移至10 mL比色管,定容.

干濕結(jié)合法:取樣品1 mL于錐型瓶中,加純水至50 mL水樣,再加0.5 mL硝酸,0.25 mL過硫酸鉀,放入玻璃珠數(shù)粒,在電爐上煮沸30 min,取下稍冷,用快速定性濾紙過濾,用硝酸溶液洗滌濾紙數(shù)次.濾液中加入0.5 mL亞硫酸鈉,用純水定容至50 m L,作為測(cè)試溶液[7].

1.7測(cè)定范圍的確定取150 mL錐形瓶12個(gè),分別加入錳標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL,各加去離子水至50 mL.再加入1.0 mL硫酸亞鐵胺溶液和1.0 mL甲醛肟試劑,混勻.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氫氧化鈉溶液,混勻后靜置10 min.再加入3 m L氨性鹽酸羥胺溶液,將溶液混勻,30 min后于450 nm波長(zhǎng)下,用1 cm比色皿以純水為參比,測(cè)定各溶液的吸光度.繪制吸光度曲線,判斷本檢測(cè)方法的測(cè)定范圍[8].

1.8準(zhǔn)確性分析取含錳10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液和健康成年犬血清各1 mL,加去離子水至50 mL,再按照1.5的方法測(cè)定其吸光度,計(jì)算出錳含量,并與用原子吸收法測(cè)定結(jié)果比較,判斷其準(zhǔn)確性[9]. 1.9干擾試驗(yàn)在含錳10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的銅、鋅、鐵、鈉、鉀、鉛、鈣、鎂、鈷,用以上試驗(yàn)方法確定最佳反應(yīng)條件,測(cè)定各溶液的吸光度值,判斷以上物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響[10].

2　結(jié)果與分析

2.1不同甲醛肟試劑添加量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

不同甲醛肟試劑添加量測(cè)得溶液吸光度值如表1和圖1所示.從圖1可以看出,在反應(yīng)溶液中添加1 mL甲醛肟試劑時(shí)測(cè)得的吸光度值最高,即此時(shí)顯色效果最好.

2.2不同反應(yīng)溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響見表1.

從表1可以看出,隨著反應(yīng)溫度的升高,測(cè)定結(jié)果變化值不大,說明溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響較小.而隨著溫度的升高,溶液的揮發(fā)量也逐步增大,溶液中錳的濃度也會(huì)隨之發(fā)生微量變化,為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,反應(yīng)宜室溫下進(jìn)行.

2.3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響從圖2可以看出,反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min以上,測(cè)定結(jié)果逐步穩(wěn)定,說明此時(shí)顯色穩(wěn)定.

圖1　不同甲醛肟試劑添加量測(cè)得溶液吸光度值

表1　不同反應(yīng)溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

圖2　不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)得溶液吸光度值

2.4不同前處理對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響對(duì)不同的前處理樣品進(jìn)行5次平行檢測(cè),其吸光度值如表2.

表2　不同前處理對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響

從表2可以看出,不作處理的樣品檢測(cè)結(jié)果比干消化法和濕消化法處理的略低,但它們之間差異不顯著(t檢驗(yàn)).采用干濕結(jié)合法處理的樣品檢測(cè)結(jié)果相差也不大,而這種方法處理時(shí)間短,且處理過程中強(qiáng)酸的揮發(fā)量大大降低,減少了對(duì)人體的傷害.

2.5測(cè)定范圍不同濃度錳溶液測(cè)得吸光度值如圖3所示.

從圖3可以看出,在測(cè)定試驗(yàn)范圍內(nèi),錳濃度>0.10 μg/L時(shí),吸光度曲線呈近似直線,用Microsoft Office Excel計(jì)算所得線性方程為y=0.0343x+0.0543, R2=0.9991,說明方程與曲線擬合程度較高.根據(jù)方程可推導(dǎo)出公式x=29.1545y-1.5831,即可根據(jù)溶液測(cè)得的吸光度值y,計(jì)算出溶液的含錳量x.若樣品量為1 mL,則最低檢測(cè)限為5 μg/L.

2.6測(cè)定方法的準(zhǔn)確性測(cè)定含錳100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液和健康成年雞血清吸光度值,并計(jì)算所得錳濃度為100.1218±0.2171 μg/L和100.2132 μg/ L.而用原子吸收光譜法測(cè)定其錳含量分別為100.0265 μg/L和100.1520 μg/L,與本試驗(yàn)方法測(cè)定結(jié)果差異不顯著(t檢驗(yàn)),說明本試驗(yàn)方法準(zhǔn)確性好,可靠程度較高.

2.7測(cè)定方法的抗干擾性1、5、10、50、100 mg/L的銅、鋅、鈷測(cè)得:銅超過5 mg/L,鎳超過2 mg/L,鋅超過錳濃度50 mg/L時(shí)對(duì)本法有干擾.在鹽酸羥胺和乙二胺四乙酸二鈉存在下,25 mL溶液中分別含有5 mg Cu2+、Fe3+、Mg3+、Al3+、Zn2+、Ca2+則對(duì)本試驗(yàn)無明顯干擾.

圖3　不同濃度錳標(biāo)準(zhǔn)使用液吸光度值

3　討論

本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好,判定系數(shù)R2= 0.9991,顯色幾乎不受溫度影響.

由結(jié)果可看出,甲醛肟的不同添加量對(duì)測(cè)定的吸光度值有不同程度的影響,其添加量為1 mL時(shí)所測(cè)得的吸光度值最高、顯色效果最好.波長(zhǎng)選擇在450 nm所測(cè)的吸光度值最準(zhǔn)確最能保證相對(duì)較高的靈敏度.溫度雖然影響不大但過低過高都不利于反應(yīng)的進(jìn)行,最適宜的是在室溫下進(jìn)行.反應(yīng)時(shí)間影響著顯色的穩(wěn)定性以及測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性,由于錳(Ⅱ)與甲醛肟形成的配合物是無色的,但是能立即被空氣中氧氧化為褐紅色的錳(Ⅳ)一甲醛肟,因此,操作時(shí)需靜置10 min,以使顯色完全.由本次試驗(yàn)測(cè)得放置時(shí)間在30 min后測(cè)得的結(jié)果穩(wěn)定而且準(zhǔn)確度也高,但超過l2 h后其穩(wěn)定性同樣會(huì)降低.

在本次試驗(yàn)中重點(diǎn)對(duì)樣品前處理的方法進(jìn)行了比較分析,由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,不同的前處理方法所測(cè)定的結(jié)果相差不大,它們都適用于血清錳的檢測(cè),但它們?cè)跁r(shí)間上,操作的簡(jiǎn)便程度上以及對(duì)人體健康方面的影響卻有著差別.干灰化法所需時(shí)間長(zhǎng),耗能大,需特定設(shè)備.濕式分解法在處理樣品過程中不易損失金屬元素,所需時(shí)間也短,有較高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,方法操作簡(jiǎn)單,易于掌握,但費(fèi)試劑,還可能帶來試劑、容器和環(huán)境的污染以及某些元素?fù)]發(fā)損失;干濕結(jié)合法,沒有污染、吸附等問題,操作簡(jiǎn)單,分析偏差小,準(zhǔn)確度高,是一種理想的方法.數(shù)據(jù)表明,本方法不僅可以減少化學(xué)試劑的消耗量,縮短消化時(shí)間,而且處理效果可以達(dá)到濕消化法和國(guó)標(biāo)干消化法的水平.

在測(cè)定范圍內(nèi)根據(jù)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出溶液中的含錳量.該方法測(cè)得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性好,可靠程度高,可予以推廣.

采用干濕結(jié)合法所測(cè)的結(jié)果受銅、鋅、鐵、鈉、鉀、鉛、鈣、鎂、鈷等離子的干擾不明顯且干擾離子容易消除.當(dāng)含鐵量較高時(shí),可加入EDTA掩蔽.準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性較好.由此可以看出,本法不僅具有較高的靈敏度,而且具有較好的選擇性,可直接用于血清中痕量錳的測(cè)定.

4　結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)國(guó)標(biāo)測(cè)定水中錳含量的方法作了改進(jìn),試驗(yàn)結(jié)果表明,采用干濕結(jié)合法對(duì)血清進(jìn)行前處理可縮短處理時(shí)間,減少由于強(qiáng)酸揮發(fā)給人體帶來的傷害;甲醛肟試劑最佳添加量為3 mL,最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min;最低檢測(cè)限達(dá)5 μg/L.改進(jìn)后的檢測(cè)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,值得推廣應(yīng)用.

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S852.5+3

A

0529-6005(2016)02-0040-04

2014-06-25

米俊憲(1982-),男,助教,碩士,從事臨床獸醫(yī)學(xué)工作,E-mail:mijx02@163.com