王黎霞,劉新月,宋麗聰,趙晨璐,張建軍,安健(.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,北京房山044;.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京昌平006)

間接血凝檢測(cè)雞柔嫩艾美耳球蟲血清抗體方法的建立

王黎霞1,劉新月2,宋麗聰2,趙晨璐2,張建軍2,安健2
(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,北京房山102442;2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京昌平102206)

為了快速檢測(cè)免疫球蟲后宿主血清中特異性抗體的水平,以DE-52層析純化子孢子、裂殖子,超聲裂解獲取可溶性蛋白;原核表達(dá)EtMIC4-N蛋白,致敏戊二醛醛化后的紅細(xì)胞,以人工免疫柔嫩艾美耳球蟲后分離的血清為陽性血清,以SPF雞分離的血清為陰性血清,建立柔嫩艾美耳球蟲間接血凝試驗(yàn).結(jié)果顯示,稀釋度為1∶2萬鞣酸處理戊二醛醛化后的紅細(xì)胞,使用100 μg/m L可溶性裂殖子、子孢子蛋白或12.5 μg/mL表達(dá)的重組蛋白EtMIC4-N均可以與陽性血清發(fā)生反應(yīng)(可達(dá)1∶1 024),與雞的陰性血清及大腸桿菌病的陽性血清無反應(yīng),與堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲陽性血清有微弱反應(yīng)(不超過1∶8).試驗(yàn)證明,該方法具有簡(jiǎn)單、方便、快捷、靈敏等優(yōu)點(diǎn).

雞柔嫩艾美耳球蟲;間接血凝試驗(yàn)

雞球蟲病是由原生動(dòng)物門寄生蟲艾美耳屬感染雞所引起的一種呈全球性分布的痢疾性疾病,其感染后可以造成雞只的生長(zhǎng)發(fā)育受阻、生產(chǎn)性能下降甚至死亡等危害.伴隨著集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展,本病的危害也必將日趨嚴(yán)重,因此,如何防治本病將成為目前養(yǎng)雞業(yè)的難題之一.

目前,我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)在很大程度上仍依賴于靠使用抗球蟲藥物或活疫苗來防治球蟲病,但由于抗球蟲藥物多存在耐藥性、環(huán)境污染和政府法律法規(guī)限制等問題有待解決,而使得相關(guān)球蟲活疫苗的研究越來越受到人們的關(guān)注,但免疫后的監(jiān)測(cè)問題仍是當(dāng)前發(fā)展疫苗所急需解決的問題之一.尋找一種快速檢測(cè)球蟲血清抗體水平的方法不僅能夠了解疫苗的免疫效果同時(shí),還可以及時(shí)監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)中宿主對(duì)球蟲免疫保護(hù)力的變化,并可以根據(jù)這些變化來進(jìn)行相應(yīng)免疫策略的改變,進(jìn)而便可以更好地防治球蟲病.目前用于檢測(cè)雞球蟲病血清抗體的方法很多,如凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等[1].本試驗(yàn)我們采用間接血凝的方法檢測(cè)雞柔嫩艾美耳球蟲免疫后的血清抗體水平,旨在提供一種方便快捷監(jiān)測(cè)雞球蟲病血清抗體的方法,為更好的采用球蟲活苗防治雞球蟲病打下基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料25%戊二醛,購自西隴化工股份有限公司;鞣酸,購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;綿羊紅細(xì)胞,采自北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院;疊氮鈉、硫柳汞及PBS試劑,購自北京廣泰偉業(yè)有限公司;蛋白表達(dá)相關(guān)試劑,購自北京康為試劑有限公司.

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenlla)BJ4孢子化卵囊由北京農(nóng)學(xué)院球蟲實(shí)驗(yàn)室保存.

1日齡小公雞,購自大興某雞場(chǎng),確保無球蟲感染.

1.2抗原液的制備(1)柔嫩艾美耳球蟲微線4 (EtMIC4-N)重組蛋白的表達(dá):EtMIC4-N重組蛋白的原核表達(dá)用北京農(nóng)學(xué)院球蟲實(shí)驗(yàn)室保存的蟲株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)純化后獲得,并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量;(2)子孢子、裂殖子抗原液的制備:用DE-52纖維素柱對(duì)球蟲子孢子、裂殖子進(jìn)行純化,經(jīng)3 500 r/min離心沉淀后加適量的pH值7.6磷酸鹽緩沖液重懸.然后反復(fù)凍融并冰浴超聲破碎,10 000 r/min離心,吸取上清液,其余沉淀反復(fù)操作如上,最后合并以上收集的上清液,使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白含量;(3)血清制備:7日齡公雛經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1X104個(gè),接種2次,間隔2周.最后1次接種1周后采心血,分離血清,作為陽性血清.用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)雞抗柔嫩艾美耳球蟲抗體的效價(jià),-20℃保存?zhèn)溆?陰性血清、堆型艾美耳球蟲陽性血清、巨型艾美耳球蟲陽性血清及雞大腸桿菌陽性血清按常規(guī)方法制備.

1.3綿陽紅細(xì)胞的醛化致敏靜脈無菌采綿羊全血,用pH值7.2的PBS 3 000 r/min離心10 min,洗滌3次后配成10%細(xì)胞懸液.取等體積的細(xì)胞懸液與1%戊二醛混勻,室溫緩慢攪拌2 h,同法洗滌3次,再用含0.1%NaN3和0.01%硫柳汞的PBS配成2.5%的細(xì)胞懸液,然后加入適量鞣酸溶液(用時(shí)配制),充分搖勻(37℃,20 min),同法洗滌3次.最后再用PBS配成2.5%紅細(xì)胞懸液,4℃保存?zhèn)溆?有效期6個(gè)月).

將綿羊紅細(xì)胞懸液與不同抗原液等體積混合,于37℃條件下致敏2 h,然后用聚乙二醇兔血清稀釋液洗滌1次,再用含0.1%NaN3、1%胎牛血清的PBS洗滌3次后配成2.5%的紅細(xì)胞懸液,即為間接血凝診斷試劑,4℃保存?zhèn)溆?另用上述方法制作一批不經(jīng)抗原致敏的紅細(xì)胞懸液做對(duì)照.

1.4間接血凝試驗(yàn)操作步驟在96孔"V"型血凝板上進(jìn)行.將陽性血清、陰性血清及待檢血清用PBS作1∶2、1∶4、1∶8……倍比稀釋,最后1孔不加血清作為對(duì)照,每孔均為50 μL.然后向試驗(yàn)孔和對(duì)照孔分別加入致敏和非致敏紅細(xì)胞懸液50 μL,輕輕振蕩搖晃,置37℃溫箱中2 h,觀察凝集結(jié)果. 1.5結(jié)果判定紅細(xì)胞集中于孔底,呈規(guī)則點(diǎn)狀,周圍液體清亮,為陰性.紅細(xì)胞均勻鋪于孔底,周圍液體呈云霧狀;或紅細(xì)胞凝集成圈;或邊緣有不規(guī)則凝集塊等,均為陽性.并按其反應(yīng)的強(qiáng)度分為"+++"、"++"、"+".

2　結(jié)果與分析

2.1抗原制備制備的子孢子、裂殖子抗原液經(jīng)檢測(cè)濃度分別為:0.5 mg/m L和1.4 mg/m L.采用徐賡、周賽等[2]人的方法成功表達(dá)EtMIC4-N重組蛋白,其大小約為85 kDa,濃度為0.3 mg/mL.其結(jié)果如圖1、2.

圖1　蛋白EtMIC 4-N純化后SDS-PAGE

圖2　W estern B lot檢測(cè)

2.2鞣酸最佳濃度的測(cè)定為了檢測(cè)鞣酸濃度對(duì)間接血凝試驗(yàn)的影響,我們使用10 mg/mL可溶性裂殖子、子孢子蛋白和重組表達(dá)的EtMIC4-N蛋白制成抗原診斷液致敏不同鞣酸濃度處理的醛化紅細(xì)胞,結(jié)果顯示,相較于可溶性的裂殖子與子孢子蛋白,重組蛋白的抗原性更高,并且使用鞣酸處理后能在一定程度上增強(qiáng)紅細(xì)胞的吸附作用,根據(jù)結(jié)果比較后,初步認(rèn)定鞣酸濃度以1∶2萬即可.其結(jié)果如圖3所示.

圖3　不同蛋白不同鞣酸濃度試驗(yàn)

2.3不同抗原最佳濃度的測(cè)定經(jīng)過測(cè)定采用12.5 μg/mL的EtMIC4-N蛋白(抗原3),100 μg/mL的子孢子(抗原1)、裂殖子蛋白(抗原2)作為抗原液致敏紅細(xì)胞,血清稀釋陽性結(jié)果均在1∶1 024或以上,空白血清及陰性血清均為陰性,因此選擇上述抗原稀釋液為最佳稀釋度,具體結(jié)果如表1.

表1　不同抗原最佳濃度的選擇

2.4特異性檢測(cè)經(jīng)過與雞大腸桿菌陽性血清、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲陽性血清反應(yīng)后,結(jié)果顯示,大腸桿菌為陰性,當(dāng)使用EtMIC-4蛋白與堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲陽性血清作用后,效價(jià)最高不超過1∶4,裂殖子、子孢子可溶性蛋白效價(jià)最高不超過1∶8,正常陽性血清效價(jià)可達(dá)到1∶1 024,初步說明該方法特異性較良好.

3　結(jié)論與討論

間接血凝試驗(yàn)?zāi)壳耙褟V泛用于蛔蟲、瘧疾、旋毛蟲、附紅細(xì)胞體、錐蟲等的研究[3-4],目前對(duì)于其在球蟲上的研究很少,本試驗(yàn)采用3種不同抗原致敏紅細(xì)胞,檢測(cè)雞柔嫩艾美耳球蟲免疫后的血清抗體水平,均有較為良好的結(jié)果.其中,子孢子和裂殖子采用DE-52層析法純化,不需要太多的專門儀器設(shè)備,分離后的子孢子和裂殖子可以用戊二醛處理,抗原性基本不變,在4℃條件下可保存1年以上,但存在分離較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且所得的可溶性蛋白成分變化較大等缺點(diǎn).EtMIC4蛋白為子孢子裂殖子階段均有的蛋白[5-6],經(jīng)原核表達(dá)后可大量獲得,經(jīng)Western-Blot檢測(cè)其可以與柔嫩艾美耳球蟲二免后的雞血清發(fā)生陽性反應(yīng),表明其具有良好的反應(yīng)原性,可以作為血清抗體的檢測(cè)抗原,但其保存條件要求較高,需要在-80℃保存,且一般不能不超過3個(gè)月,并應(yīng)當(dāng)避免反復(fù)凍融.

本試驗(yàn)是采用戊二醛醛化紅細(xì)胞,雖然醛化后的紅細(xì)胞穩(wěn)定性較好,但只能保存6個(gè)月,仍有待進(jìn)一步改進(jìn).經(jīng)戊二醛處理后的紅細(xì)胞再經(jīng)鞣酸處理,可以增加其吸附抗原的能力,試驗(yàn)結(jié)果表明,鞣酸處理后紅細(xì)胞吸附能力在一定程度上與鞣酸濃度呈正比,為準(zhǔn)確性和節(jié)省材料,經(jīng)過試驗(yàn)確定為1∶2萬.

本試驗(yàn)以陰陽性血清的測(cè)定結(jié)果結(jié)合特異性試驗(yàn)結(jié)果來確定IHA的判定標(biāo)準(zhǔn),即:當(dāng)被檢血清效價(jià)超過1∶64時(shí),為陽性,否則為陰性.此判定結(jié)果確保試驗(yàn)兼具準(zhǔn)確性與特異性.試驗(yàn)的特異性試驗(yàn)僅檢測(cè)了3種血清,而該方法是否與其他疾病血清反應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究.

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[3]張守發(fā),張國(guó)宏,汪明,等.應(yīng)用間接血凝試驗(yàn)診斷豬附紅細(xì)胞體病[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2004,40(8):17-19.

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Establishment of indirect hemagglutination for detection of antibodies against chicken Eim eria tenella

WANG Li-xia1,LIU Xin-yue2,SONG Li-cong2,ZHAO Chen-lu2,ZHANG Jian-jun2,AN Jian2
(1.Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442,China; 2.College of Animal Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

To quickly detect the specific serum antibody levels in Eimeria tenlla infected chickens,sporozoites and merozoites were purified by DE-52,and then sonicated to obtain the soluble protein.EtMIC4-N protein was expressed in Escherichia coli ex?pression system,and the glutaraldehyde fixed red cells was sensitized with those proteins.The positive serum was separated from Ei?meria tenlla infected chickens,and the negative serum was separated from SPF chickens.And the indirect hemagglutination diagnos?tic reagent was established.The results showed that co-processing of 100 μg/m L soluble merozoites or sporozoite proteins or 10 μg/ mL EtMIC4-N protein with a dilution ratio of 1:20 000 tanned erythrocytes could occur strong reaction with positive serum,but negative serum and Escherichia coli positive serum have no response.Eimeria acervulina,and Eimeria maxima positive sera had a weak reaction.

Chicken;Eimeria tenlla;IHA

AN Jian

S858.31

A

0529-6005(2016)02-0031-03

2014-12-29

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院技術(shù)研究與示范推廣項(xiàng)目(XFYF-14-09)

王黎霞(1986-),女,講師,碩士,主要從事獸醫(yī)寄生蟲與分子生物學(xué)研究,E-mail:854544702@qq.com

安健(1968-),E-mail:anyh001@bac.edu.cn