曹志偉,孫忠晟,郭學(xué)金,王建琳,尹燕博

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島266101)

雞I型IFN及TLR-3和TLR-7實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

曹志偉1,孫忠晟2,郭學(xué)金1,王建琳1,尹燕博1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島266101)

為檢測雞抗病毒相關(guān)基因在病毒感染過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,研究建立了雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測方法.根據(jù)GenBank提供的雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7參考序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的特異引物,用常規(guī)RT-PCR方法從雞脾臟總RNA中擴(kuò)增得到雞相應(yīng)基因.將其cDNA分別克隆到pMD19-T載體中進(jìn)行測序鑒定,采用SYBR Green I染料法,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析其溶解曲線.結(jié)果表明,這4種基因的檢測靈敏度可高達(dá)46 copies/μL,且具有良好的特異性和重復(fù)性.此檢測方法的建立為動(dòng)態(tài)定量檢測及研究雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因的表達(dá)變化提供了有效的手段.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Corresponding authors:WANG Jian-lin;YIN Yan-bo

I型干擾素(Interferon,IFN)包括IFN-α和IFN-β,是機(jī)體抗病毒防御的重要組成,不僅可以通過細(xì)胞表面受體作用可使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白,同時(shí)還可增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力,被視為機(jī)體的免疫指示器[1-2].I型IFN的合成和表達(dá)是通過機(jī)體的模式識別受體的活化來完成的,其中TLR是關(guān)注較多的模式識別受體.雞的10個(gè)TLR中,和天然免疫相關(guān)的主要有TLR-3,TLR-7和TLR-15,而研究較多的為TLR-3和TLR-7[3],分別識別雙鏈RNA和單鏈RNA,二者被活化后可表達(dá)一些天然抗病毒因子,如I型IFN和促炎性細(xì)胞因子,發(fā)揮機(jī)體抗病毒天然免疫[4].

TLR-3和TLR-7可活化表達(dá)I型IFN等抗病毒因子,共同完成機(jī)體的抗病毒天然免疫反應(yīng),這是目前動(dòng)物病毒性疾病研究的重要內(nèi)容.故本研究擬建立一種用于檢測雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7分子mRNA的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,為病毒感染后這些相關(guān)基因的定量檢測提供方法.

1　材料與方法

1.1主要儀器及材料TRIZol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶、pMD19-T,購自寶生物工程(大連)有限公司;Fast Start Universal SYBR Green Master,購自青島賽尚科貿(mào)有限公司;熒光PCR儀為杭州博日科技有限公司生產(chǎn).

1.2引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank上雞相關(guān)基因的序列及文獻(xiàn)設(shè)計(jì)各自的特異引物,由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(見表1).

1.3總RNA的提取及cDNA的合成使用TRIZol-氯仿-異丙醇法提取總RNA,按常規(guī)反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄的cDNA-20℃保存.

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.4.1普通PCR擴(kuò)增常規(guī)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增.反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃30 s、55℃40 s、72℃90 s,30個(gè)循環(huán);72℃10 min;最后4℃結(jié)束反應(yīng).

1.4.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備PCR產(chǎn)物電泳,試劑盒回收目的條帶,連入pMD19-T載體中,經(jīng)PCR和測序鑒定的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行純度測定,并用紫外分光光度計(jì)測其260 nm OD值,計(jì)算其拷貝數(shù). 1.4.3建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒倍比稀釋后進(jìn)行SYBR Green I RT-PCR擴(kuò)增.50 μL反應(yīng)體系包括:SYBR Green Master(ROX)、上下游引物、模版.擴(kuò)增參數(shù):50℃2 min;95℃10 min;95℃15 s、60℃60 s,40個(gè)循環(huán).經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測后,計(jì)算Ct值,取4～6個(gè)點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.5特異性用此方法檢測TNF-α、IL-1、新城疫病毒(NDV)、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)進(jìn)行特異性驗(yàn)證,同時(shí)設(shè)陰性和陽性對照.

1.6重復(fù)性試驗(yàn)取3份不同的脾臟樣品,分別提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR.每份脾臟樣品分別作3次組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)性試驗(yàn),對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.7敏感性試驗(yàn)用1X101～1X1010copies/μL之間不同拷貝數(shù)的陽性重組質(zhì)粒分別做實(shí)時(shí)熒光定量PCR.

2　結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果表明,擴(kuò)增的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的大小與預(yù)期相符(見圖1).

圖1　IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2重組質(zhì)粒的篩選將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α內(nèi),進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,對經(jīng)菌落PCR確認(rèn)的陽性克隆菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA, PCR進(jìn)一步確認(rèn)陽性重組子.

2.3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.3.1陽性模版濃度IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7陽性質(zhì)粒模版150倍稀釋后,用紫外分光光度計(jì)測其260 nm OD值分別為:0.148、0.173、0.203、0.195;質(zhì)粒DNA濃度分別為:1 110、1 297.5、1 522.5、1 462.5 μg/μL;質(zhì)?？截悵舛确謩e為:3.5X1011、4.1X1011、4.6X1011、4.5X1011copies/μL.

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制對質(zhì)粒10倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,采用樣點(diǎn)擬合法,得出各細(xì)胞因子的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(見圖2).

2.4線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)根據(jù)上圖標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.98,結(jié)果可信度較高;標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率均在-3～-3.5之間;PCR擴(kuò)增效率(E)均在0.9～1.2之間,達(dá)到絕對定量實(shí)驗(yàn)要求.

表2　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖2　A、B、C、D分別為IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算,Ct值的變異系數(shù)(CV)值均在5%以內(nèi)(見表2),表明該方法重復(fù)性良好.

2.6敏感性試驗(yàn)檢測樣品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct>0,則結(jié)果判為陽性.用建立的方法檢測10倍梯度稀釋的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒,最小檢出模板濃度為101copies/μL.

2.7產(chǎn)物溶解曲線分析檢測樣品的溶解曲線均出現(xiàn)單峰,未見引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增片段的曲線峰,且產(chǎn)物溶解溫度相同.

2.8特異性分析結(jié)果TNF-α、IL-1、NDV、H9N2 AIV均無特異性峰出現(xiàn),無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn).

3　討論

研究認(rèn)為,雞TLR-3可識別雙鏈RNA,然后快速誘導(dǎo)I型IFN的表達(dá),且TLR-3與IFN-α和IFN-β在雞淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞系(DF-1)中以劑量依賴性的方式上調(diào)[5].TLR-7激動(dòng)劑可誘導(dǎo)雞脾細(xì)胞中IFN-α和IFN-β的表達(dá)[6].SPF雞感染NDV、IBDV毒株后,TLR-3 mRNA和TLR-7 mRNA的表達(dá)水平明顯升高,且IFN-α和IFN-β的表達(dá)也明顯上調(diào)[7].這表明雞TLR-3、TLR-7和I型IFN的表達(dá)密切相關(guān),是雞抗病毒天然免疫方面的重要指標(biāo).

PCR反應(yīng)中的SYBR Green I熒光染料被激發(fā)出熒光信號,可用來積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析[8-9].由于熒光閾值Ct與PCR體系中起始模板量的對數(shù)值之間有著嚴(yán)格的線性關(guān)系,故可用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)樣品的Ct,可以準(zhǔn)確定量出目的基因起始模板的拷貝數(shù).由本實(shí)驗(yàn)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出,不同梯度IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7陽性克隆標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct之間有較好的線性相關(guān)關(guān)系.

本試驗(yàn)過程中所構(gòu)建的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7質(zhì)粒測序結(jié)果表明,擴(kuò)增結(jié)果為預(yù)期目的序列.實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線只有一

個(gè)特異性單峰,TNF-α、IL-1、NDV、H9N2 AIV均無特異性峰出現(xiàn),且無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn),說明擴(kuò)增特異性很強(qiáng).所建立的檢測方法中,4種細(xì)胞因子的CV值均在5%以內(nèi),表明這4種檢測方法重復(fù)性良好;用所建立的方法檢測10倍梯度稀釋的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒,最小檢出模板濃度為101copies/μL,表明這4種檢測方法的靈敏度高.故本研究方法克服了SYBR Green I熒光定量RT-PCR的易產(chǎn)生非特異信號和對引物設(shè)計(jì)要求高的特點(diǎn).

綜上所述,本研究建立的方法,可以靈敏、特異、便捷地對雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7在mRNA水平進(jìn)行定量檢測,該方法的建立對雞抗病毒天然免疫相關(guān)研究具有重要意義.

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Development of real-time quantitative PCR for chicken IFN type I,TLR-3 and TLR-7

CAO Zhi-wei1,SUN Zhong-cheng2,GUO Xue-jin1,WANG Jian-lin1,YIN Yan-bo1
(1.College of Animal science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.Qingdao OLand-better Bioengineering Company,Qingdao 266101,China)

To study the dynam ic variety of chicken genes correlated with the innate immunity after infected with viruses,the real-time quantitative RT-PCR for IFN-α,IFN-β,TLR-3,and TLR-7 was developed in the study.Four pairs of primers were designed for these cytokines according to the gene sequences available in GenBank,and these four genes were amplified from total RNA from the in chicken sp leen.Then the cDNA of these four genes were cloned into the pMD19-T vector which are used as the standards after sequencing,and standard curve was established and melting curve was analyzed.The results showed that the meth?od with high detection sensitive,good specificity and repeatability.The results suggested that real-time quantitative RT-PCR de?veloped in the study will provide an efficient method for the quantitative analysis of chicken IFN-α,IFN-β,TLR-3,and TLR-7gene expression.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;real-time quantitative RT-PCR

R 446.1

A

0529-6005(2016)02-0025-03

2014-07-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272535);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-13-011-03);山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CL022)

曹志偉(1989-),男,碩士生,從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究,E-mail:czwhehehe@163.com

王建琳,E-mail:bjsxxw@126.com;尹燕博,E-mail: yanboyin2011@163.com