高 霞， 強思思#， 鄭曉萍， 胡林海， 胡芳弟*， 李應東（.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州70000；.嘉峪關市第一人民醫(yī)院脊柱外科，甘肅嘉峪關7500；.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州70000）

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［飲片炮制］

紋黨產地初加工工藝的優(yōu)化

高 霞1， 強思思1#， 鄭曉萍1， 胡林海2， 胡芳弟1*， 李應東3
（1.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000；2.嘉峪關市第一人民醫(yī)院脊柱外科，甘肅嘉峪關735100；3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州730000）

目的 優(yōu)化甘肅文縣產紋黨Codonopsis pilosula的產地初加工工藝。方法 建立18批樣品的HPLC指紋圖譜，高效液相色譜-串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS）法對色譜峰進行鑒定，DPPH法測定抗氧化活性，偏最小二乘（PLS）法分析譜效關系。結果 HPLC指紋圖譜中有26個共有峰，其中有9個特征峰對抗氧化活性的貢獻較大，尤以黨參炔苷為最。結論 最佳產地初加工工藝為鮮紋黨在80℃烘至鮮藥材凈重的64%后，50℃下烘至恒重。

紋黨；產地初加工；HPLC指紋圖譜；抗氧化活性；譜效關系；HPLC-MS/MS；DPPH；PLS

中藥產地加工是指藥材采收后進行挑選、沖洗、粗切、浸漂、蒸煮、發(fā)汗、熏烤、干燥等初步加工過程［1］，其中紋黨的傳統(tǒng)產地加工方法為首先讓淘洗后的黨參根體發(fā)軟，然后將其用細麻繩串起來，曬到三四成干后進行揉搓，捆成小捆，堆放“發(fā)汗”，繼續(xù)晾曬，揉搓后再曬，如此反復多次，最后曬干［2-3］，整個過程費時、耗力［4-5］，成藥的質量易受天氣和溫度的影響［6-7］。由于缺乏醫(yī)藥監(jiān)督部門嚴格監(jiān)管，再加上紋黨產地加工的手工操作多、體力勞動強度大，造成藥農為了追求經濟利潤而粗制亂造，還有一些不法藥材商利用加工技術不統(tǒng)一，采用摻雜造假、以次充優(yōu)等非法手段，很難保證紋黨藥材的質量［8］。另外，前期研究表明，某些傳統(tǒng)的藥材產地加工方式會造成活性成分大量降解［9］，故研究一種簡單、可行的鮮紋黨產地初加工工藝是提高和改善藥材品質的迫切要求。

中藥指紋圖譜作為一種重要的質量控制方法，在評價藥材的化學成分及其含有量差異上得到廣泛應用［10］。雙波長指紋圖譜可增加分析時所需的共有峰數(shù)量，放大藥材加工過程中成分的精細變化，可作為藥材加工過程中的質量控制手段［11］。近年來，通過中藥指紋圖譜與其生物活性構建的譜效關聯(lián)已成功應用于中藥質量的評估［12-13］。本實驗首先建立烘干、真空冷凍干燥、微波干燥及傳統(tǒng)加工方式制備的18批樣品的HPLC指紋圖譜，考查不同方式制得藥材中5-羥甲基糠醛（5-HMF）及其他主要化學成分的變化，并研究其抗氧化活性。同時，采用PLS法分析譜效關系，再通過高效液相色譜-串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS）法對相關峰進行鑒定，以期篩選出最佳鮮紋黨產地初加工工藝。

1　儀器與材料

Agi1ent 1260系列高效液相色譜儀，包括LC open LAB CDS色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)；UV-1700紫外分光光度計 （日本Shimadzu公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（美國Labconco FreeZone?公司）；微波爐（格蘭仕有限責任公司）；分析天平 （賽多利斯科學儀器北京有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀 （日本Eye1a公司）；超聲波清洗儀 （常州諾基儀器有限公司）。

黨參炔苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號136085-37-5；5-羥甲基糠醛購自Sigma-A1drich公司，批號101505508。甲醇、乙腈為色譜純；乙醇為分析純；水為重蒸餾去離子水。HPD-100大孔吸附樹脂 （鄭州勤實科技有限公司）。紋黨藥材采自甘肅省文縣中寨鎮(zhèn)大海村踏坪，經蘭州大學藥學院周印所教授鑒定為紋黨參Codonopsis pilosula的根。

2　方法與結果

2.1烘干

2.1.1新工藝Ⅰ 取同一批鮮紋黨，均分為8份，每份2.00 kg，在80℃下烘至鮮藥材凈重的50%、57%、64%、71%、79%、86%、93%、100%，50℃下烘至恒重，制得8個樣品，編號為S1～S8。每個樣品平行3份，具體見表1。

2.1.2新工藝Ⅱ 取同一批鮮紋黨，均分為7份，每份2.00 kg，分別在50、60、70、90、100、110、120℃下烘至鮮藥材凈重的64%后，50℃下烘至恒重，制得7個樣品，分別編號為S9～S15。每個樣品平行3份，具體見表1。

2.2真空冷凍干燥 取同一批鮮紋黨1.00 kg，放入凍干箱內的擱板上，開啟真空泵，使內部壓強降低，此時進入升華干燥階段，除去自由水和結合水至恒重，備用，編號為S16。每個樣品平行3份，具體見表1。

2.3微波干燥 取同一批鮮紋黨1.00 kg，置于微波爐內，高檔功率 （750 W）下加熱，每隔1 min翻動1次，觀察樣品外觀變化，并稱定質量至恒重，編號為S17。每個樣品平行3份，具體見表1。

2.4 傳統(tǒng)加工方法 取同一批鮮紋黨20.0 kg，按淘洗—上串—晾曬—揉搓—發(fā)汗—揉搓—清洗—整形 （修枝）—晾曬至恒重［2］步驟操作，編號S18。具體見表1。

表1　鮮紋黨產地初加工工藝Tab.1 Habitat primary processing technologies of fresh Codonopsis pliosula

2.5紋黨藥材的指紋圖譜研究

2.5.1色譜條件 Diamonsi1C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈 （A）-0.2%乙酸水 （B），梯度洗脫 （0～15 min，10%～20%A；15～25 min，20%A；25～35 min，20%～30%A；35～45 min，30%～45%A；45～50 min，45%～100%A）；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長267 nm；進樣量10μL。

2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷對照品1.18 mg，置于2 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成0.59 mg/mL對照品溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，4℃下放置，備用。

精密稱取5-羥甲基糠醛對照品2.59 mg，同法配制成1.295 mg/mL對照品溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，4℃下放置，備用。

2.5.3供試品溶液的制備 按 《中國藥典》2010年版附錄中測定醇浸出物的方法制備紋黨醇提液［14］。精密移取75 mL醇提液，濃縮至干，甲醇定容至5 m L，以0.5 mL/min吸附速率過大孔吸附樹脂柱，100 m L蒸餾水除去雜質，再以150 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，甲醇定容至2 mL，4℃下放置，備用。

2.5.4方法學考察

2.5.4.1精密度試驗 取同一供試品溶液，在同1天和連續(xù)3 d進樣，考察日內精密度和日間精密度，以黨參炔苷為參照峰，計算指紋圖譜中共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果表明，日內精密度相對保留時間RSD小于1.12%、相對峰面積RSD小于2.70%，而日間精密度相對保留時間RSD小于0.63%、相對峰面積RSD小于2.51%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.2穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、24和48 h檢測。結果表明，各色譜峰相對保留時間RSD小于1.23%、相對保留時間RSD小于2.51%，表明溶液在室溫下48 h內穩(wěn)定。

2.5.4.3重復性試驗 取同一樣品，按“2.5.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣檢測。結果表明，各色譜峰相對保留時間RSD小于2.25%、相對保留時間RSD小于5.25%，表明該方法重復性良好。

2.5.5共有峰的選擇 選擇18個樣品指紋圖譜中出峰時間基本一致、峰面積較大的峰作為共有峰。在波長267 nm的指紋圖譜中，標定出17個共有峰（P1～P17）；在波長320 nm的指紋圖譜中，標定出9個共有峰 （P1*～P9*），這26個峰的峰面積之和占總峰面積的90%以上。其中，P13通過與標準品保留時間和紫外光譜圖比較，鑒定為黨參炔苷，見圖1，不同加工工藝制得的18個樣品的指紋圖譜 （267 nm）見圖2。然后，與5-羥甲基糠醛標準品的保留時間和紫外光譜圖比較，發(fā)現(xiàn)僅有S14、S15和S17中含有該成分。

圖1　各樣品共有峰Fig.1 Common peaks of various samples

圖2　各樣品指紋圖譜（267 nm）Fig.2 Fingerprints of various sam p les（267 nm）

2.5.65-羥甲基糠醛的含有量測定 色譜條件為Diamonsi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相乙腈∶0.2%乙酸水 （5∶95）；體積流量1 m L/min；柱溫30℃；檢測波長284 nm；進樣量10μL。

取5-羥甲基糠醛貯備液適量，甲醇稀釋，配制成0.002、0.004、0.008 1、0.016 2、0.032 5、0.065、0.130 mg/mL標準溶液，以峰面積 （Y）對質量濃度 （X）作標準曲線，得回歸方程Y= 71 188X-8.606 9，r=0.999 5。取 “2.5.3”項下供試品溶液，0.45μm微孔濾膜過濾后進樣，結果見表2。

表2　5-羥甲基糠醛含有量測定結果Tab.2 Determ ination resu lts of 5-hydroxym ethylfurfu ral content

2.5.7樣品中26個共有峰峰面積與稱樣量的比值（表3、圖3、圖4）

由表3可知，80℃烘至不同含水量時，對樣品S1～S8指紋圖譜中P2，P1*，P2*，P3，P5，P4*，P5*，P8，P6*，P9，P11，P8*，P13，P14，P15，P16和P17的共有峰峰面積與稱樣量比值有顯著的影響，而且不同溫度烘至鮮藥材凈重64%時，樣品S9～S15指紋圖譜中P1，P2，P1*，P2*，P4，P6，P7，P5*，P8，P6*，P9，P10，P8*，P15，P16，P17的共有峰峰面積與稱樣量比值也有顯著的影響。圖3表明，P3，P6*，P9，P1*，P11，P17，P5，P8，P15，P4*，P7*，P8*，P9*的共有峰峰面積與稱樣量比值均最高。

表3　峰面積與稱樣量比值Tab.3 Ratios of peak areas to sample weights

圖4表明，P1*，P4，P6，P4*，P8，P6*，P9，P15，P16，P17，P7*，P8*，P9*共有峰峰面積與稱樣量比值均在80℃烘至鮮藥材凈重的64%時最高。

真空冷凍干燥加工工藝與傳統(tǒng)加工方式比較，P1，P2，P5，P5*，P9，P14，P16共有峰的峰面積與稱樣量比值均以傳統(tǒng)加工方式為高；微波干燥工藝與傳統(tǒng)加工方式比較，P1，P3*，P5，P6，P7*，P16共有峰的峰面積與稱樣量比值也均以傳統(tǒng)加工方式為高，其他都高于傳統(tǒng)加工方式。

2.5.8主要共有峰峰面積與稱樣量的比值相對傳統(tǒng)工藝的變化率 （表4）。

由表可知，各加工方法與傳統(tǒng)工藝比較，其平均變化率均為正值。從各峰的變化率來看，除P2*，P3*，P3，P5，P4*，P8，P8*，P14和P16 9個峰呈負相關外，其余均呈正相關。其中，在80℃烘至鮮藥材凈重的64%后，50℃下烘至恒重時平均變化率最高，為82.49%，說明與傳統(tǒng)工藝比較，該方法能最大程度保流紋黨中的有效成分。2.6 DPPH法測定各樣品的抗氧化活性 精密稱取DPPH 4 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.1 mmoL/L貯備液，于4℃下放置，備用。移取 “2.5.3”項下供試品溶液100μL及貯備液2 mL，置于同一試管中，搖勻，暗室中反應30 min，在517 nm波長下測定吸光度值As。移取貯備液2 m L與甲醇100μL，置于同一試管中，搖勻，測定混合溶液的吸光度Ab。移取甲醇2 mL與“2.5.3”項下供試品溶液100μL，置于同一試管中，測定混合溶液的吸光度Ac。然后，計算清除率，公式為清除率=［1-（A s-A c）/Ab）］× 100%，結果見圖5，發(fā)現(xiàn)除樣品S1，S7，S8和S9外，其他樣品的DPPH清除率均高于傳統(tǒng)工藝，而且在80℃烘至鮮藥材凈重的64%后，50℃下烘至恒重時最高，為56.40%。

圖3　不同鮮藥材凈重占比下峰面積與稱樣量比值Fig.3 Ratios of peak areas to sampling weights at different propor tions of netw eights of fresh medicinalmaterials

圖4　不同溫度下峰面積與稱樣量比值 （含水量50%）Fig.4 Ratios of peak areas to sam p ling weights at different tem perature（50%for water conten t）

表4　各比值的變化率Tab.4 Change rates of various ratios

圖5　DPPH自由基清除率圖Fig.5 DPPH free radical scavenging rate image

2.7譜效關聯(lián) 偏最小二乘 （PLS）法建立指紋圖譜和抗氧化活性的譜效關聯(lián)模型，以DPPH清除率為因變量，26個共有峰的峰面積為獨立變量，結果見圖6。由圖可知，HPLC指紋圖譜中9個共有峰與DPPH清除率呈正相關較大，貢獻依次為P13（黨參炔苷）＞P12＞P7*＞P15＞P10＞P17＞P4＞P9*＞P2。

圖6　譜效關聯(lián)圖Fig.6 Im ages of spectrum-effect relationships

2.8HPLC-MS/MS法鑒定特征峰成分

2.8.1質譜條件 分別進行電離源負離子和正離子模式檢測，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，黨參炔苷峰的強度更高，所以最終選擇正離子 （ESI+）檢測。毛細管電壓和錐孔電壓分別設為3.00 kV、40 V；提取電壓和RF透鏡電壓分別設為3 V和0.1 V；碰撞能20 eV；離子源溫度和去溶劑溫度分別設為120℃和350℃；脫溶劑氣體積流量和錐孔反吹氣體積流量分別設為600、50 h/L。

2.8.2鑒定結果 抗氧化活性較強的9個特征峰的碎片離子見圖7。同時，比較標準品的紫外光譜圖和保留時間后，鑒定P13為黨參炔苷。

圖7　9個特征峰的碎片離子Fig.7 Fragment ions of nine characteristic peaks

3　討論

為了優(yōu)選出一種簡單、可行、能全面改善黨參藥材質量標準的產地初加工工藝，本實驗首先考察了各樣品中醇浸出物量、水浸出物量、多糖、總黃酮、黨參炔苷和蒼術內酯Ⅲ的含有量，發(fā)現(xiàn)樣品S3的醇浸物 （55.36%）、水浸物 （54.91%）、多糖 （27.29%）、總黃酮 （1.58 mg/g）、黨參炔苷（1.90 mg/g）和蒼術內酯Ⅲ（10.95μg/g）的含有量都高于傳統(tǒng)工藝。真空冷凍干燥和微波干燥制得的樣品中，水浸物、醇浸物、黃酮、蒼術內酯Ⅲ的含有量也高于傳統(tǒng)工藝。多糖是紋黨中的主要有效成分，其含有量隨加工溫度的增加呈先增后降的趨勢，90℃烘至鮮藥材凈重的64%時最高，達52.80%，這可能是因為在較高溫度下（90℃），碳水化合物的代謝平衡被打破，纖維素、淀粉等高分子量化合物大量形成，從而使多糖含有量增加；在較低溫度下，可能加速與淀粉分解有關的酶活性的增強，如促進淀粉酶、淀粉磷酸化酶和轉化酶的活性，使淀粉轉化成葡萄糖、蔗糖等小分子糖類，從而使多糖含有量下降［15］，整個過程中糖類的積累變化還有待作更深入的研究。

比較18個樣品的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，只有高溫110、120℃和微波處理的紋黨藥材中檢測到5-羥甲基糠醛，而且其含有量隨溫度的增加而增加，符合文獻 ［16］的報道，即該成分可能是黨參中己糖或多糖類物質與阿魏酸等酸性物質在高溫條件下反應而生成。其他工藝與傳統(tǒng)工藝比較，指紋圖譜中峰數(shù)并沒有變化。

實驗結果表明，樣品S3的共有峰峰面積與稱樣量比值相對于傳統(tǒng)加工的變化率最高（82.49%），其DPPH清除率也最高（56.40%）。譜效關聯(lián)顯示，黨參炔苷 （P13）對抗氧化活性的貢獻最大。真空冷凍干燥設備的投資大、能耗高，缺少在線快速檢測水分的手段，干燥終點的判斷比較困難，干燥產品呈多孔疏松狀結構，暴露于空氣中容易吸濕和氧化［17］；采用微波干燥時，因微波爐內的空間較小，樣品過多，導致受熱不均勻，制得的樣品色澤不美觀［18］。綜合考慮，優(yōu)選的工藝為鮮紋黨在80℃烘至鮮藥材凈重的64%后，50℃下烘至恒重。

4　結論

中藥材產地加工是中藥材生產過程中的重要環(huán)節(jié)，直接影響著其品質。隨著工業(yè)化程度的不斷提升，現(xiàn)代干燥技術被逐漸引入和推廣應用，大大提升了中藥材產地加工的干燥效率，保障了中藥材品質［19］。本實驗優(yōu)選的工藝一方面可整體上提高鮮紋黨藥材的利用率，從源頭上避免藥材資源的損失，尤其是代表主要抗氧化活性成分的黨參炔苷含有量較高；另一方面，該工藝科學合理、集約高效，可滿足中藥材生產加工的要求，實現(xiàn)標準化、規(guī)范化、規(guī)?；?。而且，本實驗可為進一步探索鮮紋黨藥材中有效成分在不同干燥過程中受生物酶、微生物等因素的影響機理提供參考。

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Optim ization of the habitat primary processing technology of Codonopsis pilosula

GAO Xia1， QIANG Si-si1#， ZHENG Xiao-ping1， HU Lin-hai2， HU Fang-di1*， LIYing-dong3

（1.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.Departmentof Spinal Surgery，The First People'sHospitalof Jiayuguan City，Jiayuguan 735100，China；3.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China）

AIM To optimize the habitat primary processing techno1ogy of Codonopsis pilosula co11ected from Wen County，Gansu Province.METHODS The HPLC fingerprints of eighteen patches of samp1es were estab-1ished，whose chromatographic peakswere identified by high performance 1iquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The antioxidant activity was determined by DPPH method.And partia11east squares（PLS）was app1ied to ana1yzing the spectrum-effect re1ationship.RESULTS There were twenty-six common peaks in the HPLC fingerprints.Among them，nine characteristic peaksmade great contributions to antioxidant activity，especia11y for 1obetyo1in.CONCLUSION The best habitat primary processing techno1ogy is that fresh Codonopsis pilosula is baked to 64%ofwetweight at80℃and then to constantweight at50℃.

Codonopsis pilosula；habitat primary processing；HPLC fingerprints；antioxidant activity；spectrum-effect re1ationship；HPLC-MS/MS；DPPH；PLS

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1330-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.026

2015-11-25

蘭州市科技計劃項目 （2013-4-75，2014-2-30）；甘肅中醫(yī)藥管理局科研項目 （GZK-2014-13，GZK-2015-19）；甘肅省科技支撐計劃項目（1504FKCA010）

高 霞（1990—），女，碩士生，從事中藥成分分離分析。Te1：18293192421，E-mai1：18766108576@163.com

#共同第一作者：強思思（1982—），女，碩士生，從事中藥成分分離分析。Te1：13693016630，E-mai1：qiangsisi@163.com

胡芳弟，女，教授，碩士生導師，從事中藥成分分離分析及新藥研究。Te1：（0931）8915686，E-mai1：hufd@1zu.edu.cn