張 英， 鄭清煉， 周裕權(quán)， 周 林（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州50006；2.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州50006）

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融合菌株轉(zhuǎn)化黃芪藥渣生產(chǎn)乙醇的工藝

張 英1， 鄭清煉1， 周裕權(quán)1， 周 林2*
（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州510006）

目的 研究融合菌株轉(zhuǎn)化黃芪藥渣生產(chǎn)乙醇的工藝。方法 以黃芪藥渣為原料，運(yùn)用篩選出的融合子D2菌株，研究分步糖化發(fā)酵、同步糖化共發(fā)酵、改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵、兩步同步糖化共發(fā)酵4種工藝路線下乙醇的生產(chǎn)情況，并與高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母比較。結(jié)果 兩步同步糖化共發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)最高，為20.4 g/L，其次為分步糖化發(fā)酵、改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵、同步糖化共發(fā)酵。在相同工藝路線下，融合菌株生產(chǎn)乙醇的能力較釀酒酵母要強(qiáng)。結(jié)論

該工藝可促使乙醇產(chǎn)量得到較大幅度的提高。

黃芪；藥渣；乙醇；融合菌株

中藥藥渣來源于中成藥生產(chǎn)、中藥材加工與炮制、原料藥生產(chǎn)等，并以中成藥生產(chǎn)帶來的藥渣量最大，約占總量的70%。隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)的迅速發(fā)展，全國各大中藥制藥廠的中藥渣廢棄量日益增加，年排放量達(dá)60萬噸以上［1］。目前，中藥渣利用率低，除少數(shù)生態(tài)化利用外，大多作為市政垃圾而被大量焚燒或填埋。

近年來國外研究表明，纖維質(zhì)原料生產(chǎn)生物燃料具有廣闊的應(yīng)用前景［2-7］。中藥藥渣作為廉價(jià)的木質(zhì)纖維素原料，其主要成分為纖維素，其次為半纖維素。以往對(duì)纖維質(zhì)原料資源化的研究大多集中于纖維素的利用，而忽略了半纖維素的生物轉(zhuǎn)化，致使乙醇產(chǎn)率不夠理想。課題組通過前期研究，將樹干畢赤酵母 （能利用木糖）與釀酒酵母（能利用葡萄糖）進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到既能利用葡萄糖，又能利用木糖的融合子。中藥藥渣首先經(jīng)過纖維素酶和木聚糖酶處理，其中的纖維素和半纖維素分別被降解為葡萄糖和木糖，兩者均能被融合菌株利用而產(chǎn)生乙醇，有望在原有乙醇產(chǎn)量的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其得率。

本研究首先采用篩選出的生產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)的融合子D2，研究4種工藝路線 （分步糖化發(fā)酵、同步糖化共發(fā)酵、改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵、兩步同步糖化共發(fā)酵）下乙醇的產(chǎn)量。然后，在相同工藝路線下，比較高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母與D2菌的生產(chǎn)能力，以確定融合菌株是否優(yōu)于基礎(chǔ)菌株。

1　儀器和試劑

LDZX-50FBS立式蒸氣滅菌鍋 （上海申安醫(yī)療器械廠）；DHZ-CA振蕩器（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；CR-22G離心機(jī) （日本日立公司）。

黃芪藥渣（自制）；D2菌 （本實(shí)驗(yàn)室通過原生質(zhì)體融合得到）；安琪釀酒高活性干酵母 （安琪酵母股份有限公司）；酵母膏 （廣州環(huán)凱生物科技有限公司）；蛋白胨 （廣州環(huán)凱生物科技有限公司）；葡萄糖 （天津市福辰化學(xué)試劑廠）；瓊脂 （廣州環(huán)凱生物科技有限公司）；復(fù)合纖維素酶（廣州翔博生物科技有限公司）；多效木聚糖酶 （廣州翔博生物科技有限公司）。（NH4）2HPO4、MgSO4·7H20、NaOH、H2SO4、乙醇均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1種子的制備

2.1.1菌種的活化 活化培養(yǎng)基為1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂。將D2菌從保藏培養(yǎng)基接種一環(huán)至活化培養(yǎng)基的平板，30℃下培養(yǎng)24 h。

2.1.2種子的制備 種子培養(yǎng)基為1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。從活化培養(yǎng)基的平板上接種一環(huán)D2菌至15mL種子培養(yǎng)基 （發(fā)酵實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品接種5 mL，重復(fù)3份），30℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h。

2.2藥渣的預(yù)處理 稱取已平衡水分的黃芪藥渣10 g，倒入250mL燒瓶中，加入150mL 1.0%稀硫酸，于120℃下保溫2 h，處理后的樣品轉(zhuǎn)入250 mL血清瓶中。

2.3發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 上述樣品加入酵母膏 （0.3%）、（NH4）2HPO4（0.025%）、MgSO4·7H20（0.025%），配制好的培養(yǎng)基用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 4.8，121℃下滅菌20 min。

2.4融合菌株轉(zhuǎn)化黃芪藥渣的工藝研究

2.4.1分步糖化發(fā)酵工藝 在 “2.3”項(xiàng)下發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20 g復(fù)合纖維素酶、10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min酶解96 h。酶解產(chǎn)物于16 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，上清液轉(zhuǎn)入250mL血清瓶中，115℃下滅菌20 min。冷卻后，接入5mL種子，30℃、150 r/min下發(fā)酵96 h。

2.4.2同步糖化共發(fā)酵工藝 在 “2.3”項(xiàng)下發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20 g復(fù)合纖維素酶、10 g多效木聚糖酶、5 mL種子，30℃、150 r/min下發(fā)酵96 h。

2.4.3改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵工藝 在”2.3”項(xiàng)下發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20 g復(fù)合纖維素酶、10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min下酶解8 h。再接入5 mL種子，30℃、150 r/min下發(fā)酵96 h。

2.4.4兩步同步糖化共發(fā)酵工藝 在 “2.3”項(xiàng)下發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min下酶解8 h。再接入5 mL種子，加入5 g復(fù)合纖維素酶，30℃、150 r/min下發(fā)酵48 h。再加入剩下的15 g纖維素酶，繼續(xù)發(fā)酵48 h。

2.4.5具體工藝路線 見圖1。

2.5融合菌株D2與安琪釀酒高活性干酵母產(chǎn)酒精能力的比較 采用同步糖化共發(fā)酵工藝，融合菌株組接入的種子為5 mL液態(tài)種子，酵母組接入0.5 g活性干酵母粉。

2.6樣品中乙醇含有量的測(cè)定 參考文獻(xiàn) ［8］。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1不同工藝路線融合菌株轉(zhuǎn)化黃芪藥渣產(chǎn)乙醇的情況

各工藝路線下樣品的氣相色譜圖見圖2（傳統(tǒng)與改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵的分離效果不理想，故圖譜略去），乙醇含有量見表1。

從表可知，兩步同步糖化共發(fā)酵工藝優(yōu)于傳統(tǒng)和改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵，其原因一方面，可能是前者在前8 h內(nèi)只加入木聚糖酶，發(fā)酵液中剛開始只有木糖而沒有葡萄糖，當(dāng)菌種加入后則首先利用木糖，對(duì)乙醇產(chǎn)量的提高起著至關(guān)重要的作用［9-10］；另一方面，8 h后在發(fā)酵液中只加入25%纖維素酶，使得發(fā)酵液在接下來48 h內(nèi)葡萄糖產(chǎn)量不是太高，融合子能夠繼續(xù)利用發(fā)酵液中的木糖。文獻(xiàn) ［11-12］報(bào)道，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中既有葡萄糖又有木糖存在的情況下，菌體首先會(huì)利用葡萄糖，兩步同步糖化共發(fā)酵工藝克服了這一弊端，木糖的高效利用可導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量的提高。另外，分步糖化發(fā)酵工藝得到的乙醇含有量也高于兩者，可能是由于藥渣酶解時(shí)間較長，葡萄糖和木糖產(chǎn)量較高，使得發(fā)酵液中生物量較大，并最終得到較高產(chǎn)量的乙醇。

圖1　各工藝路線圖

表1　乙醇含有量（±s，n=3）

工藝路線　　乙醇/（g·L-1）20.4±1.5 17.3±0.9同步糖化共發(fā)酵　14.5±1.4改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵　16.3±1.2兩步同步糖化共發(fā)酵分步糖化發(fā)酵

3.2融合菌株D2與安琪釀酒高活性干酵母產(chǎn)酒精能力的比較 融合菌株和釀酒酵母均采用同步糖化共發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，而且其參數(shù)為釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇最優(yōu)的條件，氣相色譜圖見圖3。結(jié)果，在相同工藝路線下，D2菌產(chǎn)乙醇的能力較釀酒酵母強(qiáng)，前者乙醇含有量為14.5 g/L，后者為12.6 g/L。由此表明，該融合子具備雙親的特征，既能利用葡萄糖，又能利用木糖，融合菌株在釀酒酵母的基礎(chǔ)上得到改良。

圖2　各工藝路線氣相色譜圖

4　結(jié)論與討論

國內(nèi)外對(duì)纖維質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為生物燃料進(jìn)行了幾十年的研究，從最初的只能利用葡萄糖分步和同步糖化發(fā)酵，到后來的分步和同步糖化共發(fā)酵，工藝路線得到不斷改進(jìn)，而本實(shí)驗(yàn)對(duì)同步糖化共發(fā)酵工藝進(jìn)一步完善，采用兩步同步糖化共發(fā)酵。首先，前酶解時(shí)只加入木聚糖酶，讓發(fā)酵液中先產(chǎn)生木糖，保證半纖維素的高效利用。之后加入25%纖維素酶，使葡萄糖保持一個(gè)比較低的含有量。最后加入剩下的纖維素酶。此工藝較傳統(tǒng)和改進(jìn)同步糖化共發(fā)酵下乙醇的產(chǎn)量都要高，達(dá)到20.4 g/L。同步糖化共發(fā)酵是在酶解時(shí)，葡萄糖和木糖的發(fā)酵均在一個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行，與分步糖化發(fā)酵相比有諸多優(yōu)點(diǎn)，如降低成本、減少過程時(shí)間、減少污染風(fēng)險(xiǎn)等。此工藝成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，而同步糖化共發(fā)酵工藝還有進(jìn)一步完善的空間，同時(shí)其過程機(jī)制還需要作進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)比較了高活性釀酒酵母和融合子D2菌產(chǎn)酒精能力，發(fā)現(xiàn)在同樣的工藝路線下，后者乙醇產(chǎn)量高，表明樹干畢赤酵母和釀酒酵母經(jīng)原生質(zhì)體融合后，菌種得到了改良。

只有優(yōu)良的菌種和優(yōu)化的工藝才能帶來理想的結(jié)果，故后續(xù)將通過對(duì)過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，以期得到更加優(yōu)化的工藝參數(shù)，并最終得到更高產(chǎn)量的乙醇。

圖3　不同菌株發(fā)酵樣品氣相色譜圖

［1］周達(dá)彪，唐懋華.中藥渣農(nóng)業(yè)循環(huán)利用模式產(chǎn)業(yè)化探討［J］.上海蔬菜，2007（6）：112-114.

［2］Frederick W J，Lien SJ，Courchene CE，et al.Co-production of ethano1 and ce11u1ose fiber from southern pine：a technica1 and economic assessment［J］.Biomass Bioenerg，2008，32（12）：1293-1302.

［3］Jin M J，Gunawan C，Ba1an V，et al.Simu1taneous saccharification and co-fermentation（SSCF）of AFEX（TM）pretreated corn stover for ethano1production using commercia1enzymes and Saccharomyces cerevisiae 424A（LNH-ST）［J］.Bioresour Technol，2012，110：587-594.

［4］Jeihanipour A，Karimi K，Nik1asson C，etal.A nove1process for ethano1or biogas production from ce11u1ose in b1ended-fibers waste texti1es［J］.Waste Manag，2010，30（12）：2504-2509.

［5］江 丹，李旭暉，朱明軍.造紙污泥同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（11）：32-35.

［6］Zhu Z S，Li X H，Zheng QM，etal.Bioconversion of amixture of paper s1udge and extraction 1iquor from water prehydro1ysis of euca1yptus chips to ethano1using separate hydro1ysis andfermentation［J］.Bioresources，2011，6（4）：5012-5026.

［7］Park I，Kim IKang K，et al.Ce11u1ose ethano1production from waste newsprint by simu1taneous saccharification and fermentation using Saccharomyces cerevisiae KNU5377［J］.Process Biochem，2010，45（4）：487-492.

［8］張 英，吳獻(xiàn)躍，李 馨，等.中藥藥渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究［J］.中成藥，2013，35（9）：2053-2056.

［9］Kuyper M，Hartog M M，Toirkens M J，et al.Metabo1ic engineering ofa xy1ose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xy1ose fermentation［J］.FEMS Yeast Res，2005，5（4-5）：399-409.

［10］O1ofsson K，Rudo1f A，Liden G.Designing simu1taneous saccharification and fermentation for improved xy1ose conversion by a recombinantstrain of Saccharomyces cerevisiae［J］.JBiotechnol，2008，134（1-2）：112-120.

［11］Jin M J，Lau M W，Ba1an V，et aL.Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethano1using commercia1 enzymes and Saccharomyces cerevisiae424A（LNH-ST）［J］.Bioresour Technol，2010，101（21）：8171-8178.

［12］Jin M J，Sarks C，Gunawan C，etal.Phenotypic se1ection ofa wi1d Saccharomyces cerevisiae strain for simu1taneous saccharificationand co-fermentation of AFEX pretreated cornstover［J］. Biotechnol Biofuels，2013，6：108.

Q946

B

1001-1528（2016）06-1421-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.049

2015-09-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81403193）；廣州中醫(yī)藥大學(xué) “青年英才培養(yǎng)工程”資助項(xiàng)目 （QNYC20140112）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （2014A030313587）

張 英（1976—），女，副教授，研究方向?yàn)楣I(yè)三廢的處理和資源化利用。E-mai1：tjxyzyzy@163.com

周 林（1977—），男，講師，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)及其利用。E-mai1：zhou1in@gdpu.edu.cn