王柏強(qiáng)， 劉 福*， 何效平， 曾芝蘭， 江承平（.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充637000）

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杜仲葉水提液除雜工藝的優(yōu)化

王柏強(qiáng)1，2， 劉 福1，2*， 何效平1， 曾芝蘭1， 江承平1，2
（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充637000）

目的 優(yōu)選杜仲葉水提液的除雜工藝。方法 采用高速離心法、醇沉法、殼聚糖絮凝沉淀法、ZTC絮凝沉淀法、殼聚糖絮凝澄清-高速離心法、ZTC絮凝澄清-高速離心法對(duì)杜仲葉水提液進(jìn)行澄清處理，篩選出適宜的澄清方法。以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化澄清工藝。結(jié)果 最佳澄清方法是殼聚糖絮凝澄清-高速離心法，該方法處理后提取液有效成分保留率為89.5%，蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)去除率為分別為54.4%和57.5%，澄明度和穩(wěn)定性良好。結(jié)論 殼聚糖絮凝澄清-高速離心法可作為杜仲葉水提取液的最佳澄清工藝，其穩(wěn)定可行，而且有效成分損失少。

杜仲；葉；水提液；除雜；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

杜仲平壓片收載于原衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn) 《中藥成方制劑》（第11冊(cè)），為杜仲Eucommia folium葉經(jīng)提取純化后加工制成的片劑［1］，用于治療高血壓、頭暈?zāi)垦！⒀ニ嵬?、筋骨痿軟等癥。原生產(chǎn)工藝中采用水提醇沉法除雜［2］，雖能去除部分蛋白質(zhì)，但對(duì)鞣質(zhì)效果較差，而且需要耗費(fèi)大量乙醇，成本較高，周期長(zhǎng)。為了降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以杜仲葉水提液為研究對(duì)象，以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳除雜工藝。

1　儀器與試藥

1.1儀器 10A高效液相色譜儀、SPD-10A紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；Hypersic C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；TG16-WS高速離心機(jī) （湘儀離心機(jī)有限公司）；HI303磁力攪拌器 （匯爾儀器設(shè)備有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試藥 杜仲葉由重慶醫(yī)藥公司提供，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李生茂講師鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia uimoides O1iv.的干燥葉。綠原酸對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)0753-200413）；殼聚糖 （上海華凱科技貿(mào)易公司）；ZTC1+1（天津振天成科技有限公司）。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1澄清工藝考察 以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用高速離心法、醇沉法、殼聚糖絮凝沉淀法、ZTC絮凝沉淀法、殼聚糖絮凝澄清-高速離心、ZTC絮凝澄清-高速離心法對(duì)杜仲葉水提液進(jìn)行澄清工藝研究。首先對(duì)各方法進(jìn)行單因素考察，然后在各法最優(yōu)條件下進(jìn)行澄清處理，以篩選出最佳除雜方法。

2.1.1提取液制備 按處方稱取6個(gè)處方量杜仲葉，加水煎煮3次，第1次加10倍量水煎煮1 h，剩下2次加8倍量水煎煮45 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，均分成6份，備用。

2.1.2高速離心法 取 “2.1.1”項(xiàng)下提取液一份，置于10 000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上層清液，加水定容。

2.1.3醇沉法 取 “2.1.1”項(xiàng)下提取液一份，加5倍量乙醇攪拌，靜置過(guò)夜，濾過(guò)，濾液濃縮至無(wú)醇味，加水定容。

2.1.4殼聚糖絮凝沉淀法［3-5］稱取殼聚糖粉末1 g，加入1%醋酸溶液100 mL，攪拌后靜置24 h，即得1%殼聚糖溶液。取 “2.1.1”項(xiàng)下提取液一份，調(diào)節(jié)pH值至5，加熱恒溫至60℃，按0.3 g/L用量加入1%殼聚糖溶液，于100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5min，靜置，濾過(guò)，定容。

2.1.5ZTC絮凝沉淀法 配制澄清劑溶液［6］。方法為稱取ZTC澄清劑A組份1.0 g，加少量純化水?dāng)嚦珊隣?，再加純化水?00 mL，溶脹24 h，攪拌后脫脂棉過(guò)濾，即得1%黏膠液。按相同方法，將B組份用1%醋酸溶液配制成1%黏膠液。

取 “2.1.1”項(xiàng)下提取液一份，加熱恒溫至60℃，按1.0 g/L用量加入B組份，攪勻，再按0.5 g/L用量加入A組份，在100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5 min，靜置，濾過(guò)，定容。

2.1.6 殼聚糖絮凝澄清-高速離心法 取“2.1.1”項(xiàng)下提取液一份，調(diào)節(jié)pH值至5，加熱恒溫至60℃，按0.3 g/L用量加入1%殼聚糖溶液，于100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5 min，靜置，然后于10 000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液，加水定容。

2.1.7ZTC絮凝澄清-高速離心法 取“2.1.1”項(xiàng)下提取液一份，加熱恒溫至60℃，按1.0 g/L用量加入ZTC1+1絮凝劑B組份，攪勻，再按0.5 g/L用量加入ZTC1+1絮凝劑A組份，在100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5 min，靜置，然后于10 000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液，加水定容。

2.2綠原酸含有量的測(cè)定［7］

2.2.1色譜條件 Hypersic C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液 （13∶87）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；柱溫25℃。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品10 mg，50%甲醇溶解并定容至50 mL棕色量瓶中，即得0.2mg/mL對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密量取原藥液和6種方法制得的樣品各0.5 m L，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4線性關(guān)系考察 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.1、1、5、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，在 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo) （y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y= 31 820c+10 791（r=0.999 9），表明綠原酸在 2. 0～200μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5樣品含有量測(cè)定 精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸的含有量。綠原酸保留率=（除雜后藥液中綠原酸含有量/提取液中綠原酸含有量）×100%。

2.3鞣質(zhì)含有量的測(cè)定［8-10］采用以磷鉬鎢酸為顯色劑，干酪素為鞣質(zhì)吸附劑，沒(méi)食子酸為對(duì)照品的磷鉬鎢酸比色法。在堿性條件下加入磷鉬鎢酸，采用紫外分光光度法于760 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定樣品溶液中總多酚和不被吸附多酚的含有量，計(jì)算樣品中鞣質(zhì)的含有量。鞣質(zhì)去除率=［（1-除雜后藥液中鞣質(zhì)含有量 /提取液中鞣質(zhì)含有量）］×100%。

2.4蛋白質(zhì)含有量的測(cè)定［11-12］采用靈敏度高的Bradford法，以考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合后，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度值，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含有量。蛋白質(zhì)去除率=（1-除雜后藥液中蛋白質(zhì)含有量/提取液中蛋白質(zhì)含有量）×100%。

2.5篩選結(jié)果 采用綜合評(píng)分法［13-14］，選擇綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.2、0.2、0.1。澄清度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為混濁1分，較澄清2分，澄清3分，綜合評(píng)分=綠原酸保留率×50+鞣質(zhì)去除率×20+蛋白質(zhì)去除率×20+（澄清度得分/最澄清得分） ×10。結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，澄清效果依次為殼聚糖絮凝澄清-高速離心法＞ZTC絮凝澄清-高速離心法＞殼聚糖絮凝沉淀法＞ZTC絮凝沉淀法＞醇沉法＞高速離心法。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖絮凝澄清-高速離心法作為杜仲葉水提液的澄清除雜工藝。

表1　澄清方法的篩選結(jié)果 （±s）

表1　澄清方法的篩選結(jié)果 （±s）

澄明度得分　　綜合評(píng)分高速離心法方法　　綠原酸保留率/%　　鞣質(zhì)去除率/%　　蛋白質(zhì)去除率/% 87.4±0.26　45.2±0.44　48.6±0.42　3　72.5 92.7±0.47　15.3±0.29　14.8±0.17　2　59.0醇沉法　82.6±0.40　24.9±0.45　43.1±0.51　2　61.6殼聚糖絮凝沉淀法　90.4±0.48　43.9±0.32　48.4±0.37　2　70.3 ZTC絮凝沉淀法　88.5±0.39　42.5±0.29　44.7±0.54　2　68.4殼聚糖絮凝澄清-高速離心法　89.2±0.36　47.9±0.31　51.4±0.46　3　74.5 ZTC絮凝澄清-高速離心法

2.6殼聚糖絮凝澄清-高速離心工藝的優(yōu)化 在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇殼聚糖用量、藥液比、藥液溫度、攪拌時(shí)間、攪拌速度、藥液pH值及離心轉(zhuǎn)速7個(gè)因素，以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L18（37）正交表設(shè)計(jì)方案。因素水平和結(jié)果見(jiàn)表2～3，方差分析見(jiàn)表4。

表3顯示，各因素影響程度依次為A＞B＞F＞E＞G＞C＞D。由表4可知，因素 A、B、E、F具有顯著性差異（P＜0.05），而C、D、G差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。最終確定，最佳工藝條件為A3B2C2D3E2F2G3，即殼聚糖用量0.4 g/L，藥液比1∶2，藥液溫度60℃，攪拌時(shí)間6 min，攪拌速度100 r/m in，藥液 pH 5.0，離心轉(zhuǎn)速10 000 r/min。

2.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按最佳澄清工藝條件進(jìn)行6次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，測(cè)得值與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，說(shuō)明殼聚糖絮凝澄清-高速離心法合理可行，穩(wěn)定可靠。

表2　因素水平

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果

表4　方差分析

表5　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3　討論

中藥成分復(fù)雜，提取液中往往含有大量樹(shù)脂狀膠體物、鞣質(zhì)、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等無(wú)活性的雜質(zhì)成分。藥材制成膠囊、片劑、顆粒劑等制劑時(shí)，因提取浸膏固形物多，劑量大，故服用不便。杜仲平壓片以綠原酸含有量為其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，因此在對(duì)杜仲葉水提取液進(jìn)一步純化時(shí)，選擇綠原酸保留率、鞣質(zhì)去除率、蛋白質(zhì)去除率、澄明度等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并進(jìn)行綜合評(píng)分，可用于評(píng)價(jià)澄清除雜工藝的優(yōu)劣。

在篩選純化方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，醇沉法除雜后，浸膏得率較低，但有效成分損失較大，藥液中雜質(zhì)沉淀速度慢，費(fèi)時(shí)，澄清液乳光嚴(yán)重，鞣質(zhì)去除率低；高速離心法有效成分保留率相對(duì)較高，浸膏得率最大，但除雜效果不理想，澄清液長(zhǎng)時(shí)間放置易產(chǎn)生沉淀；殼聚糖絮凝澄清-高速離心法與ZTC絮凝澄清-高速離心法處理后的樣品在浸膏得率上無(wú)顯著性差異，但前者較大程度上保留了藥液中的有效成分，對(duì)鞣質(zhì)及蛋白質(zhì)的去除效果明顯，藥液澄明度好，澄清劑用量小，達(dá)到了精制中藥提取液的要求，而且成本低，操作簡(jiǎn)便。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇該方法進(jìn)行杜仲葉水提液的除雜工藝研究。

［1］馬鳳仙，赫錦錦，李 欽.RP-HPLC測(cè)定杜仲平壓片中京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量［J］.中成藥，2008，30（1）：86-89.

［2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第11冊(cè)［S］.1996.

［3］羅興洪，周進(jìn)東，吳 靜，等.殼聚糖用于咳喘寧口服液澄清工藝的研究［J］.中成藥，2002，24（5）：337-339.

［4］王柏強(qiáng)，丁 紅，杜 艷.均勻設(shè)計(jì)考察殼聚糖對(duì)杜仲葉提取液的絮凝澄清作用［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（7）：765-767.

［5］鄧 良，袁 華，喻宗沅.杜仲葉提取液除雜與脫色研究［J］.化學(xué)與生物工程，2006，23（7）：28-30.

［6］張 丹，李 毅，唐學(xué)貴，等.便塞通顆粒水提澄清工藝研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（7）：1686-1688.

［7］王柏強(qiáng)，劉 福，江承平，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選杜仲葉綠原酸的提取工藝［J］.中國(guó)藥房，2014，25（27）：2527-2529.

［8］孫 嬌，秦 莉，李桂水，等.殼聚糖對(duì)小兒咳喘靈原藥提取液絮凝除雜效果研究［J］.中草藥，2013，44（2）：174-179.

［9］劉 杰，孫 嬌，秦 莉，等.復(fù)配絮凝劑用于小兒咳喘靈原藥水提液絮凝效果研究［J］.中草藥，2013，44（8）：2246-2251.

［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［11］胡 松，程 璐，張 耕.蔥白中蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（8）：1083-1084.

［12］靳夢(mèng)亞，董 玲，戴俊東，等.Bradford法測(cè)量不同加工工藝鹿茸蛋白含量研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（3）：592-594.

［13］孫立霞，常桂娟，李秋萌，等.參玉口服液澄清工藝優(yōu)選［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（17）：4-7.

［14］劉 穎，管 娜，盛 蓉，等.參脈五味口服液澄清工藝優(yōu)選［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（16）：1354-1357.

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1001-1528（2016）06-1418-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.048

2015-05-13

王柏強(qiáng) （1979—），男，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬镏苿?。Te1：（0817）2262244，E-mai1：31618187@qq.com

劉 福 （1965—），男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)。Te1：（0817）2262246，E-mai1：nc1f91@163.com