樊敏歡　許丹寧　田允波

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院人文外語系，廣東廣州 510430；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510225；3.廣東省水禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510225）

不同濃度白術(shù)多糖及培養(yǎng)溫度對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

樊敏歡1許丹寧2田允波3

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院人文外語系，廣東廣州 510430；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510225；3.廣東省水禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510225）

據(jù)大量學(xué)者研究表明中藥多糖對細(xì)胞的生長、分化及增值都具有明顯的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)試圖通過在牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中加入不同濃度梯度的白術(shù)多糖溶液，進(jìn)而對卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，從中研究不同濃度白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞體外成熟效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量：10～50μg/ml白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟有促進(jìn)作用；中劑量：50～100μg/ml白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟作用不明顯；高劑量：150～200μg/ml白術(shù)多糖嚴(yán)重抑制牛卵母細(xì)胞的成熟，甚至使卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)皺縮。其二試驗(yàn)通過提高卵母細(xì)胞的培養(yǎng)溫度探索白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞熱應(yīng)激的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最適濃度白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞高溫培養(yǎng)有一定的保護(hù)作用。

牛卵母細(xì)胞；白術(shù)多糖；體外成熟；熱應(yīng)激

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1卵巢：取自佛山大瀝錦豐屠宰場的健康屠宰山羊

1.1.2GV期卵母細(xì)胞：通過挖卵法取得牛GV期卵母細(xì)胞。

1.1.3主要試劑及耗材：

生理鹽水（蘇州海博生物技術(shù)有限公司）

磷酸鹽緩沖液（PBS）、雙抗、M-199基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胚胎水（賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司）

發(fā)情期山牛血清、胎牛血清、液體石蠟、右旋葡萄糖（廣州蕊特生物科技有限公司）

促黃體素、促卵泡素、透明質(zhì)酸酶（廣州萊德爾生物科技有限公司）

丙酮酸鈉（廣州鑫邦生物科技有限公司）

80 % 白術(shù)多糖（批號：TY20120823）（西安天園生物制劑廠）

以下試劑均購自Sigma公司：胚胎水、NaCl（Sigma S5886）、KCl（Sigma P5405）、NaHCO3（Sigma S5761）、NaH2PO4 H2O （Sigma S9638）、Hepes（Sigma H9136）、Na Lactate（Sigma L1375）、Phenol Red solution（Sigma P0290）、CaCl2·2H2O （Sigma C7902）、MgCl2·6H2O（Sigma M2393）、3 %牛血清蛋白（BSA）（Sigma 4503）

0.22μm針頭過濾器、35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管、10 ml注射器、無菌手套、口罩、帽子等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器械及耗材。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1卵母細(xì)胞洗滌液及基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液配制

（1）洗滌液：TL-Hepes液。

（2）卵細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：TCM199+0.5496 g/L右旋葡萄糖+0.1 g/L丙酮酸鈉+0.075 g/L青霉素+0.05 g/L鏈霉素+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +10 %發(fā)情期山牛血清（牛卵母細(xì)胞）（或10 %胎牛血清（牛卵母細(xì)胞）），調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4。

1.2.2牛卵母細(xì)胞的采集方法

卵母細(xì)胞的采集直徑>2 mm 的卵泡采用注射器抽吸法，直徑＜2 mm 的卵泡采用挖卵針取卵法，收集50個(gè)左右的卵泡置于含有1.5ml TL-Hepes液的無菌培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下檢取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，選擇 A/B 級卵母細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.3卵母細(xì)胞培養(yǎng)前洗滌方法

采用微滴法洗滌卵母細(xì)胞：35 mm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿上，先滴入20μl成熟培養(yǎng)液，覆蓋液體石蠟2.5 ml，在原液滴上追加70μl成熟培養(yǎng)液，微滴總量為90μl，每個(gè)培養(yǎng)皿上可放置4個(gè)微滴，38.5 ℃、5 % CO2環(huán)境孵育4～6 h后備用。

卵母細(xì)胞從卵巢取出后，顯微鏡下挑選出A/B級卵母細(xì)胞，分別用TL-Hepes微滴洗滌5次，TCM199微滴洗滌5次。

1.2.4白術(shù)多糖原液配制方法

準(zhǔn)確稱取80 % 白術(shù)多糖12.5mg，溶于10 ml胚胎水中，充分混勻，0.22 μm過濾器過濾滅菌，配制成1 mg/ml的白術(shù)多糖原液分裝備用（有效期1個(gè)月），用時(shí)按需要進(jìn)行稀釋。

1.2.5卵母細(xì)胞培養(yǎng)方法

采用大微滴法對卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)：35 mm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿上，先滴入40μl成熟培養(yǎng)液，覆蓋液體石蠟2.5 ml，在原液滴上追加140 μl成熟培養(yǎng)液，微滴總量為180μl，每個(gè)培養(yǎng)皿上放置2個(gè)微滴。38.5 ℃、5 % CO2環(huán)境孵育4～6h備用。

選取洗滌后的A/B級卵母細(xì)胞，用撿卵針移入預(yù)平衡4～6h 的成熟培養(yǎng)液微滴內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，5 % CO2，相對濕度95 %；24～26 h（牛卵母細(xì)胞）后取出觀察結(jié)果。

1.2.6卵母細(xì)胞成熟判斷方法

將培養(yǎng)20～22h后的卵母細(xì)胞移入含有0.2 %透明質(zhì)酸酶的PBS液中，作用1～2min后，用撿卵針反復(fù)吹打，去掉卵母細(xì)胞表面包裹的卵丘細(xì)胞，用基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液洗滌3次，觀察裸露的卵母細(xì)胞，以排出第一極體作為成熟的判定標(biāo)準(zhǔn)，于顯微鏡下計(jì)算成熟數(shù)及成熟率。

1.3試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

1.3.1不同濃度白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

試驗(yàn)共分6組，第1組為對照組，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液成分：基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH；第2～6組為白術(shù)多糖組，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液成分：基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +（低劑量：10μg/ml、50μg/ml，中劑量：100μg/ml，高劑量：150μg/ml、200μg/ml）白術(shù)多糖溶液，具體分組情況如表1所示。

表1　試驗(yàn)組成熟培養(yǎng)液成分

表2　試驗(yàn)組培養(yǎng)溫度變化

1.3.2白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟高溫培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

試驗(yàn)共6個(gè)小組，每小組設(shè)置一個(gè)對照組及一個(gè)試驗(yàn)組。6個(gè)小組的對照組的成熟培養(yǎng)液成分為卵細(xì)胞成熟培養(yǎng)液 +0 μg/ml白術(shù)多糖，而試驗(yàn)組的成熟培養(yǎng)液成分為卵細(xì)胞成熟培養(yǎng)液 +50 μg/ml白術(shù)多糖。分別改變牛卵母體外培養(yǎng)溫度，具體分組情況如下：

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

表3　不同濃度的白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟率的影響

對369個(gè)牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果（3）顯示：添加濃度為50 μg/ml時(shí)，卵母細(xì)胞成熟率最高，顯著高于200μg/ml劑量組（P＜0.05），但與對照組及其他濃度劑量組差異不顯著（P>0.05），添加濃度為200μg/ml時(shí)，卵母細(xì)胞體外成熟率是所有試驗(yàn)組中最低的，與對照組差異顯著（P＜0.05）。從整體上看，中、低濃度的白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟均有較好的促進(jìn)作用，在100μg/ml時(shí)，仍能維持較高的成熟效率，150 μg/ml時(shí)雖然成熟率開始下降，但與對照組間無顯著性差異（P>0.05），可見，牛卵母細(xì)胞對白術(shù)多糖添加濃度的變化耐受范圍較寬。同時(shí)可以看出，牛卵母細(xì)胞對白術(shù)多糖濃度的依賴性較強(qiáng)，僅低濃度的白術(shù)多糖可以提高卵母細(xì)胞的成熟率，而中、高劑量的白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞的體外成熟均有不同程度的抑制作用；牛卵母細(xì)胞在中、低濃度的白術(shù)多糖培養(yǎng)液中，體外成熟率較對照組有所提高，僅在高劑量添加時(shí)，才對卵母細(xì)胞的成熟有所抑制。200μg/ml的白術(shù)多糖培養(yǎng)液牛卵母細(xì)胞出明顯的抑制作用進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞嚴(yán)重萎縮死亡，這表明白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞體外成熟的促進(jìn)作用是有明顯的劑量依賴性，并非越多越好，這與培養(yǎng)液成分的相互作用有關(guān)。

2.2白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟高溫培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

在不同濃度的白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟率的影響的試驗(yàn)中，初步測得牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的最適濃度為50 μg/ ml。本試驗(yàn)試圖提高卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)溫度，人工制造熱應(yīng)激，試圖探索白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞體外高溫培養(yǎng)有無保護(hù)作用。試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示：培養(yǎng)溫度為38.5℃時(shí)，卵母細(xì)胞成熟率較其他試驗(yàn)組高，當(dāng)溫度上升0.5℃時(shí)，對照組牛卵母細(xì)胞體外成熟率為0%而添加50μg/ml 白術(shù)多糖試驗(yàn)組牛卵母細(xì)胞的成熟率為16.68%。當(dāng)溫度上升39.5℃時(shí)，對照組牛卵母細(xì)胞體外成熟率為0%而添加了50 μg/ml 白術(shù)多糖試驗(yàn)組牛卵母細(xì)胞的成熟率為0.05%。但溫度高于40℃，無論是試驗(yàn)組還是對照組均未見卵母細(xì)胞成熟。可見白術(shù)多糖在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中產(chǎn)生了一定的過熱保護(hù)作用，大量研究文獻(xiàn)得出牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)溫度為38.5℃，但在培養(yǎng)液中加入50 μg/ml的白術(shù)多糖能拓寬牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)溫度使之能有+0.5～1℃的溫度差范圍。但是培養(yǎng)溫度過高時(shí)，本試驗(yàn)認(rèn)為高40℃，白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的保護(hù)受抑制，這可能是由于溫度過高是的細(xì)胞內(nèi)酶失去生物活性，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡。

3 小結(jié)

補(bǔ)益類中藥多糖具有控制細(xì)胞分裂、分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、衰老的功能，對細(xì)胞也有不同程度的保護(hù)作用［1-3］。本研究選用白術(shù)多糖作為添加物，對牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，旨在探討白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控作用，為優(yōu)化卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系提供試驗(yàn)依據(jù)。

表4　白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟高溫培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

3.1不同濃度白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

目前，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液均以M-199為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加生殖激素、血清、生長因子及其他營養(yǎng)成分。成熟培養(yǎng)液的成分根據(jù)培養(yǎng)卵母細(xì)胞的種類稍有差異。本試驗(yàn)在培養(yǎng)液中加入含有發(fā)情期牛（或胎牛）血清，其目的是由于發(fā)情期牛的血清中含有多種出盡卵細(xì)胞成熟的激素，添加同源性血清卵母細(xì)胞的離體成熟及發(fā)育具有重要作用。本試驗(yàn)還添加低劑量（10、50 μg/ml）、中劑量（100 μg/ml）及高劑量（150、200 μg/ml）的白術(shù)多糖溶液，觀察不同白術(shù)多糖添加濃度對卵母細(xì)胞發(fā)育能力的作用，綜合試驗(yàn)結(jié)果得出，于高劑量白術(shù)多糖均表現(xiàn)出發(fā)育停滯現(xiàn)象，尤其是添加劑量為150 μg/ml以上時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟率顯著下降，鏡檢觀察到大部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)了皺縮現(xiàn)象，說明高濃度的糖類物質(zhì)，可能會導(dǎo)致成熟培養(yǎng)液滲透壓發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)水分流失，胞質(zhì)皺縮，出現(xiàn)發(fā)育受阻現(xiàn)象。

有研究人員發(fā)現(xiàn)葡萄糖為營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)卵母細(xì)胞，高濃度（11.2 mmol/L）葡萄糖對卵母細(xì)胞的體外成熟產(chǎn)生抑制，中濃度（5.6 mmol/L）的葡萄糖培養(yǎng)液則可使卵母細(xì)胞的成熟率提高；Fraser等分別在不同濃度梯度的 D-葡萄糖的KSOM體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠二細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2、5.56 mmol/L培養(yǎng)基中二細(xì)胞胚能發(fā)育成囊胚，其他高糖濃度的則不能，結(jié)果顯示高糖環(huán)境對早期著床前胚胎有抑制作用。葡萄糖作為最單純的能量來源，其有效作用濃度應(yīng)為6.0 mmol/L以下，高于此濃度，卵母細(xì)胞成熟率均有下降。這一現(xiàn)象可能與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（glucose transporters，GLUT）有關(guān)。GLUT1基因缺乏的胚胎較野生型胚胎的細(xì)胞凋亡率要高，畸形胚胎率也高.。糖尿病模型雌鼠早期胚胎細(xì)胞中GLUT1、2、3的表達(dá)下調(diào)，體外培養(yǎng)亦顯示二細(xì)胞在高濃度（30、52 mmol/ L）糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h，GLUT的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯減少，由于 GLUT的減少使高糖環(huán)境下細(xì)胞對葡萄糖攝取減少，內(nèi)部游離血糖水平降低，細(xì)胞得不到足夠能量，可能是細(xì)胞停滯發(fā)育的另一個(gè)重要因素。

3.2白術(shù)多糖對牛卵母細(xì)胞體外成熟高溫培養(yǎng)的影響

卵母細(xì)胞在體外繼續(xù)發(fā)育對生長環(huán)境要求非常嚴(yán)格，溫度、氣相、培養(yǎng)液的pH值、移動(dòng)的次數(shù)等均可影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，本研究采取升高環(huán)境溫度的手段，對卵母細(xì)胞造成人為有害刺激，以此觀察白術(shù)多糖對卵母細(xì)胞成熟的保護(hù)作用，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，對于牛卵母細(xì)胞，但溫度高于39℃，卵母細(xì)胞大多停滯發(fā)育，但通過在培養(yǎng)液中加入50 μg/ml的白術(shù)多糖，能夠很好地保護(hù)卵母細(xì)胞免受熱應(yīng)激的影響。在溫度為38.5～39.5℃時(shí)，試驗(yàn)組仍有卵母細(xì)胞成熟，這表明白術(shù)多糖對于牛卵母細(xì)胞抵抗不良環(huán)境的能力作用更加顯著。

［1］毛健，馬海樂.靈芝多糖的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2010，31 （1）：295-299.

［2］吳梅，譚睿.黃芪多糖研究進(jìn)展［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28 （1）：17-22.

［3］田允波，許丹寧，黃運(yùn)茂，等.白術(shù)多糖免疫調(diào)控作用的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2010，42（9）：98-100.

楊琪（1994—），女，本科，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)。