陸袁洲，殷樂，范標(biāo)，王為群，邱祖紅，曹新宇，王緯經(jīng)，衣昕

(1南通市通州區(qū)人民醫(yī)院，江蘇南通226399；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系)

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·基礎(chǔ)研究·

姜黃素對脂多糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用及機(jī)制

陸袁洲1，殷樂1，范標(biāo)1，王為群1，邱祖紅1，曹新宇1，王緯經(jīng)1，衣昕2

(1南通市通州區(qū)人民醫(yī)院，江蘇南通226399；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系)

目的研究姜黃素對脂多糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。方法 取新生1～2 d的SD大鼠乳鼠體外按差速貼壁分離法純化培養(yǎng)心肌細(xì)胞，設(shè)空白對照組、脂多糖組、脂多糖+姜黃素低劑量(12.5 mg/L)組、脂多糖+姜黃素中劑量(25 mg/L)組、脂多糖+姜黃素高劑量(50 mg/L)組。在相差倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，并利用圖象分析系統(tǒng)測算細(xì)胞體積；考馬斯亮藍(lán)法檢測細(xì)胞的總蛋白含量；ELISA法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)；采用Till陽離子測定系統(tǒng)觀察細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間變化。結(jié)果與空白對照組相比，脂多糖組心肌細(xì)胞體積顯著增大，細(xì)胞總蛋白含量明顯增多，釋放的TNF-α水平顯著增高(P<0.01)，心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間峰值明顯增高。與脂多糖組相比，脂多糖+姜黃素低、中、高劑量組心肌細(xì)胞體積變小、總蛋白含量減少、TNF-α水平降低、細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間峰值降低，且呈劑量依賴效應(yīng)。結(jié)論 姜黃素對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生及Ca2+超載有關(guān)。

心肌細(xì)胞肥大；姜黃素；脂多糖；腫瘤壞死因子α；Ca2+;大鼠

心肌肥大是多種心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是這些疾病的常見并發(fā)癥，主要在長期壓力負(fù)荷過重的情況下發(fā)生，初期的心肌肥大有一定的代償意義，后期失代償則嚴(yán)重影響心肌功能，嚴(yán)重可致心力衰竭。因此，防治和逆轉(zhuǎn)心肌肥大一直是心血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)課題之一[1]。姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的活性成分，具有清除氧自由基、減輕缺血缺氧造成的心肌損傷、抑制梗死后心室重塑、改善心功能[2]等功能。2014年4月～2015年12月，本研究探討了其對脂多糖(LPS)誘發(fā)大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新出生1～2 d SD大鼠的乳鼠，雌雄不拘，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑及儀器：LPS(Sigma公司)；姜黃素(陜西森弗生物技術(shù)有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(江蘇碧云天)；Fura-2/AM熒光探針(東仁化學(xué)科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所);CO2培養(yǎng)箱(Sheldon Manufacturing Inc)；倒置顯微鏡(奧林巴斯,日本)；79-1磁力加熱攪拌器(江蘇金壇中大儀器廠)；TDL-4型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)；倒置相差顯微鏡(佳能,日本)；DNM-9602G酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；Till陽離子測定系統(tǒng)(德國)；CIAS-1000型細(xì)胞圖象像分析系統(tǒng)(中國大恒集團(tuán)有限公司)。

1.2SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)用75%乙醇消毒，無菌條件下取出心臟，用D-Hanks液洗凈，然后除去心臟相連的大血管及心房組織，再用眼科剪剪成小的組織塊，用0.08%的胰蛋白酶反復(fù)吹打，37 ℃恒溫消化10 min，棄上清液，再用0.08%的胰蛋白酶消化3～4次，收集消化完畢的細(xì)胞，置于含有DMEM的培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1.5 h。隨后將未貼壁的心肌細(xì)胞懸液用吸管吸出，以4×108/L接種于培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞分組及培養(yǎng)上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，接種于置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白對照組、LPS組、LPS+姜黃素低劑量組、LPS+姜黃素中劑量組、LPS+姜黃素高劑量組，每組各24孔。空白對照組不做特殊處理；LPS組，培養(yǎng)液中加入LPS 1 mg/L；LPS+姜黃素低劑量組，姜黃素 12.5 mg/L孵育30 min后，再加入LPS 1 mg/L；LPS+姜黃素中劑量組，姜黃素 25 mg/L孵育30 min后，再加入LPS 1 mg/L；LPS+姜黃素高劑量組，姜黃素 50 mg/L孵育30 min后，再加入LPS 1 mg/L；上述各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞體積測定上述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每組各取6孔，相差倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化并攝片。每孔隨機(jī)選擇4個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)算機(jī)細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測量20個(gè)細(xì)胞的直徑，計(jì)算細(xì)胞體積。

1.5心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)測定上述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每組各取6孔，按考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書操作步驟測定各組心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量。

1.6心肌細(xì)胞TNF-α蛋白的測定上述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每組各取6孔，收集細(xì)胞上清液，按照大鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒說明書步驟，測定各組細(xì)胞上清液中TNF-α水平。

1.7心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間變化測定取上述每組各6孔細(xì)胞，置于含有Fura-2/AM 3 μmol/L 的DMEM培養(yǎng)基中(含有0.2%的白蛋白)，37 ℃水浴中溫孵0.5 h，HEPES緩沖液沖洗后，用HEPES緩沖液在恒溫37 ℃條件下緩慢灌流(1 mL/min)，藥物均在指定時(shí)間加入灌流液中。每次選取8個(gè)搏動(dòng)心肌細(xì)胞，測定細(xì)胞[Ca2+]i的瞬間變化。測定儀器為Till陽離子測定系統(tǒng)(德國)DM3000軟件，發(fā)射光波長為505 nm，激發(fā)光波長為340 nm及380 nm，采樣間隙為300 ms。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞體積比較空白對照組、LPS組、LPS+姜黃素低劑量組、LPS+姜黃素中劑量組、LPS+姜黃素高劑量組細(xì)胞體積分別為(1 023.9±176.2)、(2 251.3±161.4)、(1 552.6±158.4)、(1 224.5±144.9)、(1 129.7±181.1)μm3。 與空白對照組比較，LPS組、LPS+姜黃素低劑量組、LPS+姜黃素中劑量組心肌細(xì)胞體積增大(P均<0.05)。而LPS+姜黃素低、中、高劑量組的心肌細(xì)胞體積隨姜黃素劑量的增高而逐漸減小(P均<0.05)，LPS+姜黃素高劑量組的心肌細(xì)胞體積已接近空白對照組。

2.2各組心肌細(xì)胞總蛋白、TNF-α水平及[Ca2+]i峰值比較見表1。

表1　各組心肌細(xì)胞總蛋白、TNF-α水平及[Ca2+]i峰值比較

注：與空白對照組比較，△P< 0.01；與LPS組比較，*P<0.01； 與LPS+姜黃素低劑量組比較，$P<0.01；與LPS+姜黃素中劑量組比較，#P<0.01。

3　討論

LPS即內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的一種成分，LPS可以激活體內(nèi)免疫和炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，對機(jī)體造成廣泛的損害和影響，而心臟是最容易受累的器官[3～5]。大部分內(nèi)毒素血癥患者會(huì)出現(xiàn)心功能不全的癥狀，進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥厚。諸多研究表明，LPS可以誘導(dǎo)心肌肥厚，心肌細(xì)胞總蛋白含量增多，心肌細(xì)胞體積增大[6～8]。內(nèi)毒素所引起機(jī)體損傷的致病機(jī)理是通過Toll樣受體4介導(dǎo)的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路所致，而非LPS本身的效應(yīng)[9,10]。本研究結(jié)果也顯示，LPS能夠誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大，引起心肌總蛋白量增高。

TNF-α具有多種生物效應(yīng)，可通過多種生物學(xué)途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大：①與腎素-血管緊張素系統(tǒng)相互作用，引起活性氧中間產(chǎn)物增殖，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[11,12]；②能增加肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈的合成，直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大；③此外，還可以與白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6)等共同作用，引起心肌細(xì)胞肥大[13]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的同時(shí)，促進(jìn)了心肌細(xì)胞高表達(dá)TNF-α。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+在心肌肥厚和基因表達(dá)中發(fā)揮著中心作用。有研究表明，胞內(nèi)Ca2+信號(hào)增加，可以激活眾多下游信號(hào)因子，促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大[14]。本研究結(jié)果顯示，LPS可以誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間峰值升高。這可能與LPS導(dǎo)致心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶的活性降低有關(guān)，其活性降低可以造成細(xì)胞內(nèi)Na+潴留，由于細(xì)胞內(nèi)Na+增多，通過Na+-Ca2+交換，Ca2+大量流入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)由于Ca2+-ATP酶活性下降，胞內(nèi)Ca2+泵出減少，最終導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載[15]。此外有研究表明，LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞高表達(dá)的TNF-α也能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高[16]。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的活性成分，屬于多酚類，由兩個(gè)鄰甲基化的酚以及一個(gè)β-二酮組成，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，例如清除氧自由基、抗炎、減輕缺血缺氧造成的心肌損傷、抑制梗死后心室重塑、改善心功能等[2]。本研究結(jié)果顯示，與LPS相比，預(yù)加入12.5、25、50 mg/L的姜黃素均可抑制心肌細(xì)胞體積增大，抑制細(xì)胞總蛋白量增多，抑制TNF-α表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間峰值增高，且呈劑量依賴效應(yīng)。

綜上所述，姜黃素對LPS誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大有保護(hù)作用，可能與抑制細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生及Ca2+超載有關(guān)。

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南通市衛(wèi)生局青年科研基金項(xiàng)目(WQZ2014015)。

衣昕(E-mail:yixin@ntu.edu.cn)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.008

R542.2

A

1002-266X(2016)17-0026-03

2015-12-28)