李　悅，師尚禮（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州730070）

秋水仙素處理清水苜蓿胚根對(duì)染色體倍性與葉表皮細(xì)胞的誘變效應(yīng)

李悅，師尚禮*
（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州730070）

利用不同濃度的秋水仙素（0.05%、0.10%、0.20%）按處理時(shí)間（4，8和12 h）對(duì)清水紫花苜蓿萌動(dòng)種子胚根進(jìn)行誘變，通過觀察清水苜蓿根尖細(xì)胞染色體數(shù)的變化確定出誘變清水苜蓿多倍體的秋水仙素適宜劑量，并觀察葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)含物的變化。結(jié)果表明：秋水仙素的誘變可使苜蓿根尖細(xì)胞染色體數(shù)發(fā)生變異，產(chǎn)生出多種變異類型（4x＜2n＜8x、2n=8x、2n＞8x的類型）。能夠誘變出較高頻率八倍體細(xì)胞（2n=8x）的秋水仙素劑量為0.1%+8h，誘變率為13.33%。隨秋水仙素處理劑量的增加，葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞尺寸（長、寬、長/寬）、內(nèi)部葉綠體數(shù)目均發(fā)生不同程度的增加，氣孔密度則出現(xiàn)不同程度的減少。秋水仙素不同處理劑量下保衛(wèi)細(xì)胞長度、寬度、長/寬、葉綠體數(shù)目均在0.1%+8h、0.1%+12h及0.2%+4h劑量較其他處理劑量增大，而氣孔密度則在這3個(gè)處理劑量下相對(duì)較小，尤其是在0.1%+8h處理劑量變化程度最大。

清水苜蓿；秋水仙素；染色體；葉片下表皮細(xì)胞

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李悅，師尚禮.秋水仙素處理清水苜蓿胚根對(duì)染色體倍性與葉表皮細(xì)胞的誘變效應(yīng).草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（2）：141-149.

LI Yue，SHI Shang-Li.The mutagenic effects of colchicine treatment on chromosome ploidy and the leaf epidermal cells of radicles of Medicago sativa cv.Qingshui.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：141-149.

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上栽培最早的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富［1］、素有“牧草之王”的美稱［2］，不僅是畜牧業(yè)生產(chǎn)的一大經(jīng)濟(jì)支點(diǎn)，而且也是生態(tài)環(huán)境治理的先鋒草種［3］，在西部生態(tài)環(huán)境建設(shè)、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中日趨重要［4］。根莖型清水紫花苜蓿（M.sativa cv.Qingshui）是新發(fā)現(xiàn)并育成的一類紫花苜蓿新品種，其根頸部較長，形成根莖混雜區(qū)，根莖距地表相對(duì)較深，并從其根莖區(qū)發(fā)育出根狀莖，萌發(fā)新芽與幼根，出土形成新的植株，分枝能力強(qiáng)，莖稈纖細(xì)且多，是培育放牧型苜蓿的良好材料。耐牧、耐寒、耐旱，具有較強(qiáng)固土護(hù)坡和水土保持能力［5-6］，有許多栽培苜蓿不具備的植物學(xué)和生物學(xué)特征［7-8］。因此，具有潛在的飼用栽培和良好的種質(zhì)資源價(jià)值。但其葉片小且少、種子硬實(shí)率高，往往造成出苗困難和草地建植緩慢，并給種子檢驗(yàn)、經(jīng)營工作帶來很多不便。

1916年Gates［9］在研究野生龍葵（Salanum nigum）嫁接時(shí)從愈傷組織得到了四倍體植物，首先引入多倍體這一概念。20世紀(jì)初，紫花苜蓿就被認(rèn)定為具有32條染色體的四倍體植物。紫花苜蓿是同源四倍體（2n=4x= 32）植物，在它的單倍體（2n=2x=16）染色體配對(duì)過程中得到了進(jìn)一步印證。直到60年代Bingham［10］利用4x-2x雜交方法獲得了部分基因型穩(wěn)定的紫花苜蓿單倍體，在育種中各倍性紫花苜蓿材料才得到大量應(yīng)用。為了選育紫花苜蓿多倍性新品種，常采用人工誘導(dǎo)植物多倍體，其中最廣泛使用且最有效的化學(xué)誘變劑是秋水仙素［11-16］。秋水仙素能夠與分裂期細(xì)胞中的微管蛋白——異二聚體相結(jié)合，抑制微管的組裝，阻礙紡錘絲的形成，從而影響細(xì)胞分裂中后期的進(jìn)程［17］，使細(xì)胞染色體加倍。

對(duì)于植物倍性的鑒定除常用的染色體計(jì)數(shù)外，細(xì)胞學(xué)鑒定也非常重要。通常多倍體植物葉表皮細(xì)胞的氣孔明顯變大，單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)相對(duì)減少，保衛(wèi)細(xì)胞明顯增大，保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)也增加，而且這些指標(biāo)均與倍性高度相關(guān)［18］。鄭思鄉(xiāng)等［19］在撕取形態(tài)發(fā)生變異的小花盾葉薯蕷（Dioscorea parviflora）葉片下表皮進(jìn)行制片觀察測(cè)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，單位葉面積的氣孔數(shù)顯著減少，葉表皮細(xì)胞及下表皮氣孔較對(duì)照顯著變大。Sari等［20］提出單位面積上的氣孔數(shù)、保衛(wèi)細(xì)胞的大小及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目等指標(biāo)可以有效地區(qū)分植株倍性。Tambong等［21］利用秋水仙素離體誘導(dǎo)芋頭（Cocoyam）小球莖時(shí)發(fā)現(xiàn)，氣孔長度及保衛(wèi)細(xì)胞的長度與染色體數(shù)目呈正相關(guān)。到目前為止，有很多研究者已結(jié)合細(xì)胞學(xué)鑒定法與染色體鏡檢計(jì)數(shù)法對(duì)植物倍性進(jìn)行判斷，目的是要快速、準(zhǔn)確地篩選出多倍體植株。

因此，在世界范圍內(nèi)的苜蓿資源利用及育種的過程中，利用秋水仙素人工誘變多倍體已成為苜蓿多倍體育種的一個(gè)極為重要的方法。本研究在以往學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，以清水紫花苜蓿為研究材料，用秋水仙素對(duì)苜蓿萌動(dòng)種子的胚根進(jìn)行不同濃度與時(shí)間誘變，在顯微鏡下觀察、計(jì)算不同處理下根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，并對(duì)其進(jìn)行分類。同時(shí)選擇相應(yīng)處理下的苜蓿苗，在顯微鏡下觀察其葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞大小及氣孔數(shù)目的變化，確定適宜的處理濃度與時(shí)間，旨在為選育多倍體清水紫花苜蓿新品種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)計(jì)

1.1.1試驗(yàn)材料供試材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院育成的國審品種（2010年）-根莖型清水紫花苜蓿，種子由草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。于2014年進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2萌動(dòng)種子胚根處理及盆栽試驗(yàn)挑選大小均勻、顏色較深、籽粒飽滿的清水紫花苜蓿種子，放入蒸餾水中浸泡12 h，選擇吸脹的種子整齊地?cái)[放在鋪有濾紙直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中（80粒/皿），加入適量蒸餾水（蒸餾水不能流動(dòng)為宜），放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待種子萌動(dòng)，胚根長至0.5～1.0 cm時(shí)，分別用濃度為0.05%、0.10%和0.20%的秋水仙素（產(chǎn)自上海展云化工有限公司）溶液處理，以清水處理為對(duì)照，分別處理4，8和12 h之后取出，用蒸餾水沖洗干凈，再放入恒溫箱（23℃上下）繼續(xù)培養(yǎng)，胚根根尖長至1.0～2.0 cm時(shí)，制片觀察根尖細(xì)胞染色體數(shù)目變化。并挑選大小均勻飽滿的清水紫花苜蓿種子，用蒸餾水浸泡一段時(shí)間，選擇吸脹的種子整齊地?cái)[放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并及時(shí)補(bǔ)給水分，待種子萌動(dòng)并長出胚根后，用秋水仙素溶液進(jìn)行不同處理（同1.1.2），處理結(jié)束后用濾紙吸干殘余處理液，將經(jīng)處理的萌動(dòng)種子移至裝有沙子的塑料杯中（高7.8 cm，口徑8.0 cm），于室溫下培養(yǎng)。

1.2測(cè)定指標(biāo)和方法

1.2.1根尖細(xì)胞染色體鑒定待胚根根尖長至1.0～2.0 cm時(shí)，切取根放入0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液中處理2.5 h，用蒸餾水沖洗干凈，用卡諾固定液（純酒精∶冰醋酸=3∶1），在4℃冰箱內(nèi)固定22 h，倒去固定液，用95%乙醇沖洗2～3次，直到?jīng)]有醋酸氣味為止，注入80%乙醇，放入冰箱內(nèi)保存。取若干根用45%的醋酸處理3 h，再用1 mol/L HCl 60℃水浴解離9～10 min，然后用石炭酸-品紅染液染色，一般2 h左右，待染色后用蒸餾水清洗3次，取一根尖置于載玻片上，由鑷子或解剖刀切取根尖尖端1～2 mm，加一滴醋酸溶液，在酒精燈上微熱以加深顏色，待根尖呈深紅色時(shí)蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片，使各細(xì)胞及各細(xì)胞內(nèi)的染色體分散開。每個(gè)處理制片5張，每張片觀察50個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目［17］，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞染色體加倍情況，計(jì)算含各倍性細(xì)胞所占比例，并選擇分散相好的片子用Axio Scope.A1光學(xué)顯微鏡照相。

1.2.2葉片表皮細(xì)胞氣孔與保衛(wèi)細(xì)胞鑒定待苜蓿幼苗長出3～5片真葉時(shí)于晴天上午9：00葉片氣孔張開時(shí)分別取同一部位的成熟葉片，放入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）中固定7 d，固定結(jié)束后在1 mol/L鹽酸中處理2 h，之后用鑷子在載玻片上輕輕擠壓使葉肉游離而得到表皮，滴1～2滴I2-KI染液進(jìn)行染色后加蓋玻片，在Axio Scope.A1光學(xué)顯微鏡下（40倍物鏡）隨機(jī)觀察10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野氣孔的數(shù)目，并在100倍油鏡下隨機(jī)測(cè)量10個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞的長寬，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野內(nèi)10個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目（葉綠體被I2-KI染成褐色或黑褐色），選擇有代表性的視野進(jìn)行顯微照相。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及差異顯著性檢驗(yàn)。

圖1　未經(jīng)秋水仙素處理的根尖細(xì)胞染色體Fig.1　The chromosome of root tip cells without colchicine treatment

圖2　經(jīng)秋水仙素處理的根尖細(xì)胞染色體數(shù)的變化情況Fig.2　The changes of root tip cells chromosomes number with colchicine treatment

2　結(jié)果與分析

2.1秋水仙素對(duì)清水苜蓿根尖細(xì)胞染色體數(shù)的影響

清水紫花苜蓿是四倍體豆科植物，其染色體數(shù)目為2n=4x=32條（A類）（圖1）。經(jīng)秋水仙素處理后根尖細(xì)胞出現(xiàn)不同水平的變異，細(xì)胞內(nèi)部染色體數(shù)發(fā)生不同增加，產(chǎn)生出不同染色體類型：4x＜2n＜8x（B類）、2n=8x（C類、八倍體）、2n＞8x（D類）（圖2）。

2.2秋水仙素不同處理劑量下根尖細(xì)胞內(nèi)含各倍性細(xì)胞所占比例

如表1所示，隨著處理劑量的增加，A類、B類染色體細(xì)胞整體減少，而C類、D類染色體細(xì)胞整體逐漸增加。A類染色體細(xì)胞比例在0.05%+4h處理劑量最高，且與0.05%+12h間差異顯著（P＜0.05）。B類染色體細(xì)胞比例0.2%+12h處理劑量最大，且與其他處理劑量均無顯著差異。C類染色體細(xì)胞比例0.1%+8h處理下達(dá)最大值，為13.33%，與其他各處理劑量均無顯著差異；而D類染色體的細(xì)胞比例在0.2%+8h處理劑量最大，且顯著高于0.1%+4h、0.2%+4h（P＜0.05）。總體來說，若以含2n=8x的染色體細(xì)胞比例大小來評(píng)價(jià)多倍體誘變效果，從2n=8x細(xì)胞（C類）出現(xiàn)頻率來看，0.1%+8h處理劑量苜蓿加倍率較高，為13.33%。

表1　不同處理劑量下各倍性細(xì)胞所占比例Table1　The proportion of all the ploidy cells under different dose%

2.3葉片下表皮細(xì)胞氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的變化

鑒定經(jīng)過秋水仙素誘變后苜蓿苗是否發(fā)生變異產(chǎn)生多倍體，除鑒定細(xì)胞染色體數(shù)以外，葉片下表皮細(xì)胞氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞大小形狀變化與倍性之間也有著密切關(guān)系。隨著秋水仙素處理濃度與時(shí)間的增加，經(jīng)誘變的苜蓿苗葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞明顯增大，形態(tài)也有所變化，其內(nèi)的葉綠體數(shù)也隨之增加，但氣孔密度則相對(duì)減少（圖3）。

圖3　對(duì)照苗與變異苗氣孔保衛(wèi)細(xì)胞變化情況Fig.3　The changes of stomatal guard cells between the contrast seedlings and the mutant seedlings

2.3.1秋水仙素不同處理劑量下葉片下表皮細(xì)胞氣孔密度的變化如圖4所示，隨著秋水仙素處理劑量的增加氣孔密度整體呈遞減趨勢(shì)。其中，在0.1%+8h處理下氣孔密度達(dá)最小值，與其他各處理劑量均差異顯著（P＜0.05）；其次在0.2%+4h處理劑量氣孔密度較低，只與0.1%+12h處理劑量無明顯差異外（P＞0.05）；再次，在0.1%+12h處理組合下較低，除與0.05%+8h、0.1%+4h、0.2%+4h及0.2%+8h處理劑量無明顯差異外（P＞0.05），與其他各處理劑量均有顯著差異（P＜0.05）；除此之外，0.05%+4h與0.2%+12h處理劑量也有較顯著差異。綜上所述，0.1%+8h、0.1%+12h及0.2%+4h處理劑量氣孔密度下降最明顯，且尤以0.1%+8h處理劑量降低程度最大，說明該處理劑量下苜蓿苗倍性較其他處理組合下高。

2.3.2秋水仙素不同處理劑量下葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞的變化如圖5，隨著秋水仙素處理劑量的增加，葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)的保衛(wèi)細(xì)胞形狀發(fā)生一定的增加。在0.1%+8h處理劑量保衛(wèi)細(xì)胞長度達(dá)最大值，且與其他處理劑量均差異顯著（P＜0.05）；其次，在0.2%+4h處理劑量保衛(wèi)細(xì)胞長度較大，只與0.1%+12h無明顯差異（P＞0.05）；再次，在0.1%+12h處理劑量較大，只與0.1%+12h和0.2%+8h劑量無明顯差異（P＞0.05）；除此之外，保衛(wèi)細(xì)胞長度在0.05%+8h處理劑量與處理劑量亦差異顯著（P＜0.05）；除上述變化之外，其他各處理劑量也發(fā)生相應(yīng)的變化。

如圖6所示，保衛(wèi)細(xì)胞的寬度隨秋水仙素處理劑量的增加也發(fā)生一定程度的增加。其中在0.1%+ 8h、0.1%+12h與0.2%+4h三個(gè)處理劑量保衛(wèi)細(xì)胞寬度較其他處理劑量增大，其從大到小的順序?yàn)椋?.1%+8h＞0.1%+12h＞0.2%+4h，但這3個(gè)處理劑量保衛(wèi)細(xì)胞寬度差異并不顯著（P＞0.05），而與其他各處理劑量差異均較顯著（P＜0.05）；同時(shí)，保衛(wèi)細(xì)胞寬度在其他處理劑量也發(fā)生了相應(yīng)的變化，且均較對(duì)照苗增加。

由圖7可以看出，保衛(wèi)細(xì)胞長/寬隨著秋水仙素處理劑量的增加也有所增加，其變化趨勢(shì)與長度與寬度的變化類似。保衛(wèi)細(xì)胞長/寬在0.1%+8h處理劑量達(dá)最大值，且與其他各處理劑量均有顯著差異（P＜0.05）；其次在0.2%+8h、0.1%+12h與0.2%+4h處理劑量有較大值，從大到小的順序?yàn)?.2%+4h＞0.1%+12h＞0.2%+8h，但這3個(gè)處理劑量差異并不明顯（P＞0.05），而它們均與其他處理劑量差異較顯著（P＜0.05）；與此同時(shí)，保衛(wèi)細(xì)胞長/寬在其他各處理劑量也較對(duì)照苗發(fā)生了一定程度的增加。

綜上所述，0.1%+8h處理劑量保衛(wèi)細(xì)胞的變化程度最為明顯，其次在0.1%+12h、0.2%+4h、0.2%+8h處理劑量也有較明顯的變化，說明這些處理劑量下苜蓿苗倍性較其他處理劑量高。

圖4　不同處理劑量下氣孔密度的變化Fig.4　The changes of stoma density under different dose

圖5　不同處理劑量下保衛(wèi)細(xì)胞長度的變化Fig.5　The changes of guard cells length under different dose

圖6　不同處理劑量下保衛(wèi)細(xì)胞寬度的變化Fig.6　The changes of guard cells width under different dose

圖7　不同處理劑量下保衛(wèi)細(xì)胞長/寬的變化Fig.7　The changes of guard cells length/width under different dose

圖8　不同處理劑量下葉綠體數(shù)目的變化Fig.8　The changes of chloroplast number under different dose

2.3.3秋水仙素不同處理劑量下保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)部葉綠體數(shù)目的變化如圖8所示，隨著秋水仙素處理劑量的增加，葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)的保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)部葉綠體數(shù)目發(fā)生一定程度的增加。其中在0.1%+8h、0.1%+12h、0.2% +4h處理劑量增加程度較大，且這3個(gè)處理劑量均無顯著差異（P＞0.05），其大小順序?yàn)椋?.1%+8h＞0.2%+ 4h＞0.1%+12h；而它們與其他各處理劑量差異均較顯著（P＜0.05）；除此之外，其他處理劑量葉綠體數(shù)目也發(fā)生了不同程度的增加。由此可知，苜蓿經(jīng)秋水仙素誘變后出保衛(wèi)細(xì)胞大小增加外，其內(nèi)部的葉綠體數(shù)也隨之出現(xiàn)增加趨勢(shì)，且與苜蓿倍性變化呈正比。

3　討論

3.1秋水仙素不同濃度與時(shí)間處理對(duì)多倍體誘導(dǎo)的影響

目前，多倍體育種已得到人們的廣泛關(guān)注，而自然界染色體加倍的頻率是很低的，為了滿足遺傳改良和育種需要，需獲得更多并且更高倍性的植物作為遺傳變異的基礎(chǔ)，人們逐漸開始探索人工誘導(dǎo)多倍體植物的途徑，其中最常用的人工加倍植物染色體方法就是利用化學(xué)藥劑來誘導(dǎo)，這種方法既方便又經(jīng)濟(jì)。目前為止使用最廣泛并且最有效的化學(xué)試劑為秋水仙素［12-14］，并已有很多成功的案例。在牧草育種過程中，也有很多品種被成功的誘導(dǎo)出同源四倍體及同源多倍體，其中在黑麥草（Lolium perenne）和三葉草（Trifolium pretense）上多倍體誘導(dǎo)已見成效［12-13］。秋水仙素濃度及處理時(shí)間是影響染色體加倍效果的兩個(gè)重要因素。因此，在植物多倍體誘導(dǎo)研究中，選擇適當(dāng)?shù)那锼伤貪舛群吞幚頃r(shí)間是至關(guān)重要的。秋水仙素水溶液從0.03%～0.50%和處理時(shí)間從6 h～7 d都有報(bào)道［22］在利用秋水仙素溶液處理植物體的過程中，對(duì)于所采用的方法、處理濃度的大小及處理時(shí)間的長短等，不同研究者有不同的看法［23］，學(xué)者通常在探究濃度與時(shí)間的組合是偏向高濃度短時(shí)間或者低濃度長時(shí)間［24］，是根據(jù)材料的不同而選擇適宜的濃度與時(shí)間以獲得更多、更理想的材料。有些研究者如李潔等［25］認(rèn)為選擇低濃度的秋水仙素，較長時(shí)間的處理會(huì)獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果。而另一些研究者，如武曉陽等［26］則傾向于選擇高濃度的秋水仙素，較短時(shí)間的處理。對(duì)于同一種植物材料而言，隨著秋水仙素濃度的升高細(xì)胞染色體的加倍率也提高，但秋水仙素對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用也跟著加大。因此對(duì)于具體的材料，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)那锼伤貪舛群吞幚頃r(shí)間。很多誘導(dǎo)多倍體的試驗(yàn)證明，想找出最有效的多倍體誘導(dǎo)方法應(yīng)把處理時(shí)間和處理濃度組合起來，篩選出最佳的處理濃度和處理時(shí)間。本試驗(yàn)首先對(duì)秋水仙素處理時(shí)間與濃度對(duì)苜蓿根尖細(xì)胞染色體數(shù)的影響做了初步研究，以確定誘導(dǎo)苜蓿多倍體的最佳處理濃度及時(shí)間。通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度在0.05%處理短時(shí)間時(shí)對(duì)染色體加倍的影響差異不顯著。而0.1%+8h處理劑量染色體加倍率最高（13.33%），更易于誘導(dǎo)出多倍體苗，其次，0.2%+4h處理劑量較高（11.33%），再次，0.05%+12h處理劑量較高（10.67%）。因此在本試驗(yàn)中可得出能夠誘變苜蓿多倍體的最適秋水仙素劑量為0.1%+8h。在以往對(duì)植物多倍體研究很多報(bào)道中，均認(rèn)為高頻多倍體誘導(dǎo)需要的秋水仙素濃度越高處理時(shí)間越短，濃度越低處理時(shí)間越長。本試驗(yàn)中秋水仙素處理材料的誘導(dǎo)效果也表現(xiàn)出類似的特征。因此，選擇秋水仙素適宜處理劑量對(duì)較理想的多倍體誘導(dǎo)極其重要。

3.2細(xì)胞學(xué)鑒定方法在多倍體鑒定中的應(yīng)用

經(jīng)過秋水仙素誘變處理后的材料，只有很小一部分可以誘變成功，從眾多誘變材料中準(zhǔn)確并快速地鑒定出多倍體是成功獲得多倍體的重要環(huán)節(jié)。通過采用多個(gè)鑒定方法相結(jié)合的方法更加準(zhǔn)確地對(duì)誘變材料進(jìn)行判斷，將多倍體挑選出來。由于多倍體最本質(zhì)的特征是染色體加倍，因此，染色體鏡檢計(jì)數(shù)是最準(zhǔn)確鑒定方法之一，該方法不僅直觀，而且準(zhǔn)確、快捷，并且隨著染色體制片技術(shù)的成熟，該方法已被廣泛采用。本試驗(yàn)對(duì)清水紫花苜蓿萌動(dòng)種子胚根根尖細(xì)胞進(jìn)行壓片觀察，發(fā)現(xiàn)隨著秋水仙素處理濃度與處理時(shí)間的增加，根尖細(xì)胞染色體發(fā)生變異，產(chǎn)生出多種變異類型（4x＜2n＜8x、2n=8x、2n＞8x的類型），并且含有不同類型染色體的細(xì)胞所含比例也有所不同。但在0.1%+8h處理劑量誘變八倍體細(xì)胞（2n=8x）最理想，加倍率為13.33%。其次在0.1%+12h及0.2%+4h處理劑量加倍率也相對(duì)較高。

除此之外，由于多倍體植物的最基本特征是它的“巨大型”，而此特征一般并不是指細(xì)胞在數(shù)量上的增加，而是其體積的增大［27］。因而進(jìn)行植物多倍體鑒定時(shí)，細(xì)胞體積的大小也可作為重要鑒定指標(biāo)之一。觀測(cè)細(xì)胞體積的大小，一般通過對(duì)植物葉片表皮進(jìn)行剝離并制片，觀測(cè)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的大小，經(jīng)過簡單的染色進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)量的變化；葉片保衛(wèi)細(xì)胞間氣孔大小和密度、保衛(wèi)細(xì)胞大小及葉綠體數(shù)目等均可用作倍性鑒定［27］。魯文英和漆燕玲［28］以二倍體的飼用甜菜通過染色體加倍技術(shù)得到的四倍體飼用甜菜為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)氣孔的長度、寬度以及氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，二倍體與四倍體植株的氣孔長度、寬度和保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)之間有著明顯的差異；對(duì)二倍體與四倍體植株保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的平均值進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)可將保衛(wèi)細(xì)胞長度和保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目相結(jié)合作為飼用甜菜多倍體篩選的鑒定指標(biāo)。Miehael等［29］通過再生植株葉片每對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目多少鑒定二倍體和四倍體植株。有研究顯示，氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞大小及葉綠體數(shù)與倍性成顯著正相關(guān)［30］，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.8以上，而氣孔密度與倍性成負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)以清水苜蓿為材料，對(duì)通過秋水仙素誘變的變異株葉片下表皮細(xì)胞制片觀測(cè)得出，秋水仙素不同處理濃度與不同處理時(shí)間下，葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞的大小、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目均隨著秋水仙素處理濃度的增加與處理時(shí)間的延長而出現(xiàn)一定程度的增加，而氣孔密度則有一定的減少；在秋水仙素處理濃度與時(shí)間互作處理下，保衛(wèi)細(xì)胞長度、寬度、長/寬、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目的增加程度均在0.1%+8h、0.1%+12h及0.2%+4h處理劑量較為明顯，以0.1%+ 8h最為明顯；而氣孔密度則在0.1%+8h、0.1%+12h及0.2%+4h處理劑量降程度較為明顯，以0.1%+8h處理劑量最為明顯。因此，0.1%+8h、0.1%+12h及0.2%+4h處理劑量苜蓿苗的倍性均較其他處理組合高。以往很多研究得出，加倍后的植株，其葉片表皮細(xì)胞單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)目減少，保衛(wèi)細(xì)胞尺寸增加，葉綠體數(shù)目增多等顯著特征，而這些特征均與植物的倍性極其相關(guān)。本試驗(yàn)中秋水仙素處理材料的誘導(dǎo)效果在葉片下表皮細(xì)胞中的體現(xiàn)也表現(xiàn)出類似的特征。因此，苜蓿多倍體的鑒定應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用的需求結(jié)合不同的鑒定方法更準(zhǔn)確地進(jìn)行多倍體的鑒定，為今后苜蓿多倍體新品種的育種工作奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

（1）秋水仙素處理可使苜蓿胚根根尖細(xì)胞染色體發(fā)生變異，產(chǎn)生出多種變異類型（4x＜2n＜8x、2n=8x、2n＞8x的類型）。

（2）以秋水仙素0.1%+8h處理劑量來誘變八倍體細(xì)胞（2n=8x）較為理想，加倍率為13.33%。

（3）隨著秋水仙素處理劑量的增加，葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞尺寸（長、寬）及保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目均發(fā)生不同程度的增加，保衛(wèi)細(xì)胞間氣孔密度則出現(xiàn)不同程度的減少。

（4）秋水仙素不同劑量下保衛(wèi)細(xì)胞長度、寬度、長/寬、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目均在0.1%+8h、0.1%+12h 及0.2%+4h較其他處理劑量大，而保衛(wèi)細(xì)胞間的氣孔密度則在這3個(gè)處理劑量相對(duì)較小，而0.1%+8h處理劑量變化程度最大。

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The mutagenic effects of colchicine treatment on chromosome ploidy and the leaf epidermal cells of radicles of Medicago sativa cv.Qingshui

LI Yue，SHI Shang-Li*
Major in Turf Management in the College of Pratacultural Science，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070，China

The objective of this experiment was to determine the appropriate colchicine dose levels to produce polyploids of Medicago sativa cv.Qingshui.Three different colchicine concentrations（0.05%，0.10%，0.20%）and three treatment durations（4 h，8 h，12 h）were used to induce the radicle of gemmiferous seeds and changes were observed in the root tip cell chromosome number and in inclusions in the lower epidermis of leaves.The results showed that colchicine can change chromosomes in the root tip cells of alfalfa seedlings，producing a variety of different mutant types（4x＜2n＜8x，2n=8x and 2n＞8x）.The appropriate dose and treatment period of colchicine to induce a higher proportion of octaploid cells（2n=8x）is 0.1%+8h，with a mutation rate of 13.3%.Increasing levels of colchicine were associated with increases in the size（length，width，length/width）of guard cells and in the number of chloroplasts in the leaves'lower epidermis，while the density of stomata decreased.The size of guard cells and number of chloroplasts were largest in the 0.1%+8h，0.1+12h and 0.2%+4h treatments，where stomatal densities were also relatively the smallest.The largest mutagenic effects were observed under the 0.1%+8h treatment.

Medicago sativa cv.Qingshui；colchicine；chromosome；lower epidermis cell of leafs

10.11686/cyxb2015122

2015-03-10；改回日期：2015-04-20

農(nóng)業(yè)部牧草種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目（NB2130135）資助。

李悅（1989-），女，甘肅白銀人，在讀碩士。E-mail：807653824@qq.com

Corresponding author.E-mail：shisl@gsau.edu.cn