袁進成，宋晉輝，馬海蓮，甕巧云，王凌云，趙　艷，劉穎慧（河北北方學院農林科技學院，河北張家口075000）

轉玉米ZmABI 3-L基因增加擬南芥的抗旱和耐鹽性

袁進成**，宋晉輝**，馬海蓮，甕巧云，王凌云，趙艷，劉穎慧*
（河北北方學院農林科技學院，河北張家口075000）

ABI3（abscisic acid insensitive 3）是編碼ABA信號轉導途徑中的重要調控因子，廣泛地存在于玉米、小麥、水稻等谷類作物中。本研究從玉米中獲得一個新的ABI3-like基因，命名為Zm ABI 3-L，該基因全長1735 bp，開放閱讀框1212 bp，編碼蛋白含404個氨基酸。同源比對表明Zm ABI3-L和谷子、高粱的同源蛋白相似性高，分別為64%和58%?；虻谋磉_分析表明該基因是組成型表達，在幼胚、穗子和花絲中表達量較高，同時基因的轉錄水平可以為鹽、ABA、干旱和冷所誘導。將Zm ABI3-L基因轉化到擬南芥中，對T3代轉Zm ABI3-L基因擬南芥進行抗逆性分析，結果顯示Zm ABI 3-L基因可以增強擬南芥的耐鹽和抗旱能力。在150 mmol/L高鹽培養(yǎng)基中轉基因擬南芥的根和莖長度分別為對照的8.6和1.4倍，在50 mmol/L甘露醇的滲透培養(yǎng)基中轉基因植株的發(fā)芽率是74.5%，而對照僅為33.6%。研究表明Zm ABI 3-L是一個對干旱和鹽損傷均有響應而顯著上調的基因，同時該基因可以增加擬南芥的抗旱和耐鹽性。

Zm ABI3-L基因；玉米；干旱脅迫；鹽脅迫；轉基因擬南芥

http：//cyxb.lzu.edu.cn

袁進成，宋晉輝，馬海蓮，甕巧云，王凌云，趙艷，劉穎慧.轉玉米Zm ABI 3-L基因增加擬南芥的抗旱和耐鹽性.草業(yè)學報，2016，25（2）：124-131.

YUAN Jin-Cheng，SONG Jin-Hui，MA Hai-Lian，WENG Qiao-Yun，WANG Ling-Yun，ZH AO Yan，LIU Ying-Hui.A maize abscisic acid insensitive 3 gene confers drought and salt stress tolerance in Arabidopsis.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：124-131.

Abscisic acid insensitive 3（ABI3）屬于具有B3結構域（B3 domain-containing protein family）基因家族的亞家族，是參與ABA信號轉導途徑的重要信號因子［1］。ABI3家族基因最早在玉米中發(fā)現(xiàn)并命名為VP1，該基因和擬南芥的ABI3基因為同源基因，參與種子萌發(fā)調控、植物的生長和發(fā)育以及植物應答逆境脅迫反應等多種生命過程［2-3］。ABI3蛋白含有4個結構域，分別為A1、B1、B2和B3結構域，其中A1結構域在酸性的N基末端，是一個富含酸性蛋白的轉錄激活結構域；B1結構域可以結合ABI5、bZIP10、bZIP25和TRAB1等bZIP類轉錄因子；B2結構域結合G-box因子（CACGTG）或者ABA應答因子，在參與細胞核定位和轉錄激活中起重要的作用；B3結構域在體外結合RY基序（CATGCA）［4-5］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中獲得許多abi3突變體，其中abi3-5的表型明顯，植株表現(xiàn)明顯的持綠性。abi3-5種子對ABA敏感，在種子萌發(fā)期表型顯著，和玉米（Zea mays）的vp1突變體一樣也表現(xiàn)了早熟的特性。在擬南芥中表達ABI3增加了At2S3，AtCRC，AtEM1，AtSOM和At EM 6的表達量，35S：ABI3轉基因種子對ABA更加敏感［6］。

ABI3廣泛地存在于多種植物中，如玉米、擬南芥、小麥（Triticum aestivum）、燕麥（Avena sativa）和水稻（Oryzasativa）中均有發(fā)現(xiàn)，Wang等［7］通過生物信息學手段搜尋11個物種的B3家族基因，結果顯示ABI3雖然廣泛存在，但是含量較B3家族其他基因要少得多：如擬南芥中B3家族基因95個，而ABI3家族僅具有3個，棉花（Gossypium hirsutum）B3家族基因130個，ABI3家族具有3個，高粱（Sorghum bicolor）B3家族基因80個，ABI3家族具有4個，柑橘（Citrus reticulata）B3家族基因42個，ABI3家族具有5個。Wang等［7］在玉米基因組中搜索到81個B3基因，其中ABI3基因僅有4個，Reidt等［8］僅在玉米中發(fā)現(xiàn)5個ABI3基因，由上可見玉米中的ABI3基因不多，而且多數的基因功能還未知［7-8］。本課題獲得玉米中一個新的ABI3基因，并深入研究基因的功能，可以為綜合了解玉米ABI3基因的功能提供一些參考信息。

1　材料與方法

1.1植物材料

玉米自交系綜31于2013年在河北北方學院農場種植，正常田間管理。收集不同時期的組織，液氮中迅速保存供后續(xù)RNA和DNA的提取。提取RNA和DNA的材料包括出苗10 d幼苗的根、莖、葉，以及授粉期的花絲、穗子和授粉15 d的幼胚。擬南芥（哥倫比亞品種）由本實驗室保存，在光照培養(yǎng)箱中種植。

1.2玉米幼苗的培養(yǎng)及脅迫處理

因為Zm ABI 3-L基因的一段EST序列是從玉米苗期干旱脅迫的cDNA文庫獲得，為研究該基因是否響應逆境脅迫，做了如下脅迫處理。將適量的水和蛭石攪拌均勻后裝入花盆，播種玉米，蓋上保鮮膜，置溫室培養(yǎng)。將發(fā)育10 d的幼苗轉移到發(fā)芽盒中在水培條件下培養(yǎng)半天后，再分別移入相應溶液中進行脅迫處理，在不同時間點取樣，處理時間分別為0，0.5，1，3，6，12，18，24和48 h，收集玉米幼苗液氮中速凍保存供提取RNA用。不同脅迫處理液分別為（1）ABA（脫落酸）處理：加100μmol/L ABA溶液；（2）鹽處理：加入250 mmol/L NaCl；（3）干旱處理：加入20%PEG（聚乙二醇）；（4）低溫處理：將生長在盆中的幼苗直接放在4℃冰箱中培養(yǎng)，取材時間點同上。

1.3基因的擴增和RT-PCR

根據NCBI提供的信息（Gen Bank：XM＿008665221.1），設計擴增Zm ABI3-L基因的引物，正向引物：5′-CATCCAACAGGGACAGGCAG-3′，反向引物：5′-GGTAGCGACGGAAGGAAGAA-3′。以玉米幼苗cDNA為模板，利用pfu Taq mix（天根）進行PCR擴增，20μL反應體系中包括10μL pfu Taq mix，1μL cDNA，正向引物和反向引物各1μL（10μmol/L），7μL dd H2O。擴增條件為95℃變性3 min，隨后35個循環(huán)，循環(huán)條件為：95℃（30 s），59℃（30 s），72℃（1 min），循環(huán)后72℃延伸5 min，3次擴增結果進行測序。同時設計構建載體引物引入相應酶切位點，正義：5′-ATCCccat ggGACAGGCAG-3′（NcoⅠ位點），反義：5′-GGTggtgaccGAAGGAAGAA-3′（Bst E II位點），酶切PCR產物，同時用相應的酶酶切植物表達載體p CAMBIA1300，將基因連接到植物表達載體上，在35S啟動子驅動下表達。

利用RT-PCR分析基因在不同組織的表達量，設計基因的特異性引物，正義：5′-CGGGTCAAATACAGT-CACACA-3′和反義：5′-CTCCTGCTCTTCCTCCTCTTT-3′，擴增出約380 bp的基因特異性片段，同時擴增350 bp的玉米actin基因作為內參，引物為正義：5′-CAGCAACTGGGATGATATGG-3′，反義：5′-ATTTCGCT TTCAGCAGTGGT-3′。利用pfu Taq mix（天根）進行PCR擴增，20μL反應體系中包括10μL pfu Taq mix，1 μL cDNA，正向引物和反向引物各0.5μL（10μmol/L），8μL dd H2O。擴增條件為95℃變性3 min，隨后28個循環(huán)，循環(huán)條件為：95℃（30 s），57℃（30 s），72℃（1 min），循環(huán)后72℃延伸5 min，在1%凝膠電泳檢測基因的表達情況。

利用real-time PCR研究基因的誘導表達特性，在熒光定量PCR儀上分析（PTC200），所用的引物為：正義：5′-CGGGTCAAATACAGTCACACA-3′和反義：5′-CTCCTGCTCTTCCTCCTCTTT-3′，同時擴增350 bp的玉米actin基因作為內參（引物同上），利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits及Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI公司）試劑。20μL反應體系中包括10μL Power SYBR Green PCR Master Mix，1 μL cDNA（稀釋后），正向引物和反向引物各0.5μL（10μmol/L），8μL dd H2O。采用的Real-time PCR程序為95℃30 s預變性，40個擴增循環(huán)（95℃10 s，59℃30 s），從59℃加熱到90℃的熔解過程，每個樣品設3次重復。

1.4擬南芥轉基因及轉基因植株抗旱性和耐鹽性的測定

于2014年采用花序浸染法轉Zm ABI3-L基因到擬南芥中［9］。將T1代種子表面消毒后均勻鋪灑在含有25 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上，置22℃光照（光周期為16 h光照/8 h黑暗）生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取正常生長15 d的幼苗移栽到培養(yǎng)土中繼續(xù)生長直到收獲種子，結合PCR擴增驗證，共篩選2代直到得到純合的轉基因株系。RT-PCR對Zm ABI 3-L基因特異性引物進行擴增，同時actin基因做內參（方法和引物同1.3）。選取Zm ABI3-L基因表達量高的T3代純合轉基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子點播在含有不同濃度的NaCl（0，50，100和150 mmol/L）和甘露醇（50 mmol/L）的MS固體培養(yǎng)基上，以不含滲透劑的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)對應種子為對照（CK），每培養(yǎng)皿培養(yǎng)約50粒種子，測定種子發(fā)芽率、幼根和幼莖的長度，重復3次。

1.5生物信息學分析

基因生物信息學分析用NCBI數據庫和玉米基因組數據庫（http：//w ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，http：//ww w.maizesequence.org/index.html和http：//maizegdb.org）?；虻倪M化樹分析和同源性比對采用DNAMAN軟件，基因的保守位點和3維結構的構建利用swiss-modle軟件。

2　結果與分析

2.1Zm ABI 3-L基因的克隆和特征

前期，通過構建玉米苗期干旱脅迫的cDNA文庫，獲得一段456 bp的EST序列，用該序列在NCBI和玉米基因組數據庫中查詢［10］。結果表明玉米B73一段cDNA（XM＿008665221.1）和我們獲得的EST有99%的相似性，同源搜尋顯示該序列為ABI3-like基因，屬于B3家族ABI3亞家族，查詢結果顯示該基因為一個新的ABI3基因，目前還沒有研究報道，故設計引物，擴增基因的全長，并將該序列命名為Zm ABI 3-L，進行深入研究。Zm ABI3-L基因全長1735 bp，開放閱讀框1212 bp（圖1A），編碼蛋白質大小為404 AA，蛋白質分子量43.35 k D。通過蛋白質數據庫（swiss-modle）對獲得的Zm ABI3-L蛋白進行保守位點和蛋白質結構預測，蛋白的3維結構顯示Zm ABI3-L主要是螺旋-折疊-螺旋的結構（圖1B）。同時，我們研究了基因的序列趨異性，與其他已知的ABI3蛋白進行比較，從圖中可見，該蛋白保守性較低，和其他的ABI3有很多的差異性殘基，這也意味著不同的ABI3基因具有不同的功能，其功能差異也很大（圖1C）。

同源查詢及聚類分析表明Zm ABI3-L蛋白與谷子及高粱的ABI3蛋白相似性高，聚在一起，與谷子的同源蛋白（XM＿004976535）相似性為64%，和高粱的同源蛋白（XM＿002448339）相似性為58%，與大麥（Hordeum vulgare）的同源蛋白（AK374546）相似性為52%，同時該蛋白和水稻的兩個同源蛋白（XM＿006647631和NM＿001187130）、大麥（FP096459）、柏樹（Selaginella moellendorffii）（XM＿002991492）的同源蛋白具有較高的相似性（圖2）。

圖1　ZmABI 3-L的克隆和特征分析Fig.1　Clone and analysis of ZmABI 3-L

圖2　不同物種ABI3蛋白的同源性比對和聚類分析Fig.2　Alignment and phylogenetic analysis of the Zm ABI3-L proteins with other plants homolog protein

續(xù)圖2　不同物種ABI3蛋白的同源性比對和聚類分析Continued Fig.2　Alignment and phylogenetic analysis of the Zm ABI3-L proteins with other plants homolog protein

圖3　定量PCR分析ZmABI 3-L基因的表達情況Fig.3　Expression analysis of the ZmABI3-L by RT—PCR

圖4　基因誘導表達情況Fig.4　Relative expression level of ZmABI 3-L under different abiotic stress

2.2Zm ABI 3-L基因的表達特性

RT-PCR研究基因在不同組織的表達情況，結果表明基因是組成型表達的，在不同部位均檢測到了基因的表達。其中根、莖和葉的表達量較低，花絲、穗子和幼胚的表達量較高，以幼胚的表達量最高（圖3）。Zm ABI3-L在不同組織的差異表達或許和其功能相關。提取不同脅迫處理玉米幼苗的RNA通過定量PCR分析Zm ABI 3-L基因的表達量，結果表明Zm ABI3-L基因的表達受冷、干旱、ABA和鹽脅迫誘導上調表達（圖4）。鹽脅迫處理基因的表達量在處理后12 h表達量最高，為對照的3.36倍，隨后表達量迅速下降到對照相近水平（圖4 A）。干旱處理基因的表達隨著處理迅速提高，到處理3 h時基因的表達量達到最高，為對照的2.23倍，隨后表達量逐漸降低，到48 h時表達量達到最低（圖4B）。冷脅迫處理時，基因在開始脅迫時表達量略有下降，當達到3 h時表達量為對照的1.54倍，隨后開始下降（圖4C）。ABA處理時基因迅速應答，處理0.5 h時表達量就為對照的近1.85倍，處理3 h時表達量達到最高，為對照的2.34倍（圖4D）。從基因的誘導表達特性可見Zm ABI 3-L基因是受多種非生物脅迫誘導表達的，意味著它在應答脅迫反應中可能起重要作用。

2.3Zm ABI 3-L基因增加擬南芥的抗旱與耐鹽性

從Zm ABI3-L基因的表達特性可見，該基因受多種脅迫誘導表達，其可能在玉米抗逆境脅迫中起作用，為深入研究其功能，將該基因轉到擬南芥中，研究基因的作用。本實驗共獲得7株轉基因植株，經過2代篩選培養(yǎng)后，得到5株T3代轉基因純合植株，RTPCR檢測基因表達量顯示轉基因株系的Zm ABI 3-L基因有較高的表達量（圖5 A），選取Zm ABI3-L基因表達最高的株系（line 5）進行深入研究。首先耐鹽實驗結果表明在不同鹽濃度的培養(yǎng)基生長，轉基因植株和野生型植株的耐鹽性不同。測量在不同濃度鹽溶液中培養(yǎng)7 d植株的根和幼莖的長度（圖5B），結果顯示在沒有脅迫處理的培養(yǎng)基中（0 mmol/L），轉基因植株和野生型植株的根和莖長度差別不大，而在不同濃度的鹽溶液下兩種植株生長差異顯著。在50 mmol/L的培養(yǎng)基對兩種植株的幼莖影響不大，野生型為0.73 cm，而轉基因植株為0.82 cm，比野生型略長；在100 mmol/L鹽培養(yǎng)基中野生型為0.227 cm，而轉基因為0.313 cm，150 mmol/L鹽培養(yǎng)基對轉基因和野生型都有較大的損害，野生型的損害更加明顯，野生型為0.09 cm，而轉基因為0.127 cm，為野生型的1.4倍。高鹽對根的損傷也很明顯，在50 mmol/L鹽培養(yǎng)基中野生型的根長為3.71 cm，而轉基因植株根長略高，為4.02 cm，100 mmol/L鹽培養(yǎng)基對擬南芥的根損傷非常明顯，野生為1.31 cm，轉基因植株為2.11 cm，150 mmol/L鹽培養(yǎng)基野生型為0.23 cm，而轉基因植株為1.97 cm，為野生型的8.6倍。

圖5　轉ZmABI 3-L基因擬南芥耐鹽性提高Fig.5　Enhanced salt tolerance of ZmABI3-L-over expressing Arabidopsis thaliana

圖6　ZmABI3-L基因提高擬南芥的抗旱性Fig.6　Germination assays of ZmABI3-L-over expressing plants under drought stress

將轉基因和野生型植株分別種植在50 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基上進行耐旱性鑒定，結果可見無論從長勢還是發(fā)芽率上轉基因植株都要較野生型好，在甘露醇滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，轉基因植株的發(fā)芽率為（74.5±2）%（圖6A），而野生型為（33.6±3）%，大部分野生型種子沒有萌發(fā)（圖6B）。隨機選取各種基因型10株植株進行測量（圖6C），結果顯示轉基因植株根的平均長度為（2.65±0.3）cm，莖的平均長度為（0.32±0.11）cm，而野生型根的平均長度為（0.43±0.12）cm，莖的平均長度為（0.21±0.08）cm（表1）。轉基因植株的幼苗健康、濃綠，而野生型長勢瘦弱、發(fā)黃。

表1　轉ABI3-L基因擬南芥在干旱脅迫下的發(fā)芽率和植株長度的變化Table1　The germination and plants length was changed under drought stress of ZmABI3-L-over expressing and WT plants

3　討論

ABA是植物重要的激素，在植物的生長發(fā)育、種子萌發(fā)、促進衰老等方面起重要作用，隨著對其研究的深入發(fā)現(xiàn)它在植物應答干旱、高鹽、低溫等逆境反應中也起重要的作用，是植物的重要抗逆境因子［11］。越來越多的研究表明，ABA在生物體內最主要的功能是其作為脅迫激素參與了植物對外界脅迫條件的應答［12-13］。

ABI3家族是ABA信號途徑中的重要信號因子，屬于B3轉錄因子家族，在植物的生長發(fā)育中起重要的作用，ABI3可以和多個轉錄因子結合如LEC1，LEC2和FUS3，這些因子同時也可以控制ABI3在植物體內的表達。研究表明ABI3的作用是多方面的，如玉米的VP 1基因在種子成熟中起作用，vp 1突變體表現(xiàn)種子早熟性。擬南芥的ABI3在黑暗誘導植株頂芽的衰老中起重要的作用，通過轉基因已經證明ABI3/VP1同源蛋白在種子和胚的發(fā)育中起重要的作用；擬南芥的LEC2基因和FUS3是ABI 3最近的同源基因，它們也參與調控種子發(fā)育過程和多種生命過程，在植物發(fā)育的早期階段，LEC2基因決定著胚柄細胞和子葉的發(fā)育，在植物發(fā)育的晚期階段，LEC基因可以使種子抗干燥的能力大大增加［14-15］。ABI3的作用并不僅僅局限于種子發(fā)育的調控中，Brocard等［16］從擬南芥中分離鑒定出一種突變體，可以使植株對ABA敏感性降低，具有抑制細胞的伸長、阻止纖維素的合成、影響維管的分化等功能，并且在氣孔調節(jié)、脅迫應答基因表達調控方面出現(xiàn)障礙?；ㄉˋrachis hypogaea）中發(fā)現(xiàn)的ABI3/NP 1基因可以調控胚對脫落酸的敏感性、調控胚中葉綠素的降解和花青素的合成、使種子獲得抗干燥能力和抑制不成熟種子的萌發(fā)等作用。水稻中克隆到ABI8基因，是一個對干旱和鹽害均有響應而顯著上調的基因可能參與ABA和乙烯信號互作調控擬南芥根的生長［16-18］。

目前許多物種的ABI3基因還沒有進行深入研究，尤其是它們在ABA介導的信號通路中的作用還遠遠未知。本文的初期研究表明Zm ABI 3-L基因可以應答多種逆境脅迫因子，同時轉基因到擬南芥中可以增加擬南芥的抗性，是一個潛在的脅迫耐受候選功能基因。ABA發(fā)揮特定生理功能的機制是非常復雜的，對脅迫信號如何通過Zm ABI3-L來精確應答，還需要繼續(xù)深入研究。

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A maize abscisic acid insensitive 3 gene confers drought and salt stress tolerance in Arabidopsis

YUAN Jin-Cheng**，SONG Jin-Hui**，MA Hai-Lian，WENG Qiao-Yun，WANG Ling-Yun，ZHAO Yan，LIU Ying-Hui*
College of Agriculture and Forestry，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China

The abscisic acid insensitive 3 gene（ABI3）has been widely studied in cereals such as wheat，maize and rice however，the functions of ABI3 have not been fully described.In this paper，a novel maize ABI3 like gene was cloned and named Zm ABI 3-L.This gene was predicted to encode a transcription factor with a distinct DNA-binding B3 domain.The full length of the gene was 1735 bp and with an opening read frame of 1212 bp and encoded 404 amino acids.Alignment of the Zm ABI3-L proteins with other plants revealed similarities with ABI3 protein from other species.RT-PCR analysis showed Zm ABI 3-L was up-regulated in maize by dehydration，salt，cold and ABA stress.Over-expression of Zm ABI3-L in Arabidopsis plants could enhance salt and drought stress tolerance compared to the wild type.The results suggest that Zm ABI 3-L may be involved in salt and drought resistance signaling pathways in maize.

Zm ABI 3-L；maize；salt stress；drought stress；transgenic Arabidopsis

10.11686/cyxb2015330

2015-06-30；改回日期：2015-09-30

國家自然科學基金（31101155），河北北方學院重大項目（ZD201305），河北省科技廳項目（13226326）和河北省高等學科拔尖人才選拔與培養(yǎng)計劃（BR2-234）資助。

袁進成（1970-），男，河北張家口人，副教授。E-mail：nkxyjc@163.com。宋晉輝（1978-），女，河北安國人，碩士。E-mail：nkxsjh@ 163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

Corresponding author.E-mail：leely519@126.com