王歡　方煌　李瀟　高書濤　周傳坤　鄒銀雙　李鋒

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)及鑒定

王歡方煌李瀟高書濤周傳坤鄒銀雙李鋒

目的探索人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法，并對此方法培養(yǎng)的iPSCs進(jìn)行鑒定。方法將人iPSCs接種于玻璃粘連蛋白（Vitronectin XF）包被的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，采用EDTA消化傳代。倒置顯微鏡下觀察iPSCs的生長狀態(tài)；堿性磷酸酶（ALP）染色鑒定；采用PCR和免疫熒光檢測iPSCs多能性基因SSEA-1、Nanog、Sox2的表達(dá)情況。結(jié)果倒置顯微鏡下可見iPSCs呈典型的克隆狀生長，克隆呈圓形或橢圓形，邊界清晰、整齊；ALP染色結(jié)果陽性；PCR結(jié)果顯示人iPSCs強(qiáng)表達(dá)多能性基因SSEA-1、Nanog、Sox2；免疫熒光結(jié)果顯示多能干細(xì)胞特異性指標(biāo)SSEA-1、Nanog、Sox2均呈陽性。結(jié)論無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系培養(yǎng)人iPSCs，細(xì)胞能穩(wěn)定增殖，保持自我更新潛能及多能性。

多能干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；無飼養(yǎng)層

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是一種借助重編程技術(shù)獲得的多能干細(xì)胞［1，2］，不僅具有類似于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的增殖能力和多能性［3］，可被誘導(dǎo)分化為運(yùn)動神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等［4-6］，而且還規(guī)避了ESC及成體干細(xì)胞面臨的倫理道德、法律、難以大量獲取等問題，具有更廣闊的應(yīng)用前景［7］。由于iPSCs的飼養(yǎng)層培養(yǎng)法面臨步驟繁瑣、工作量大、細(xì)胞純化困難等問題，且未達(dá)到臨床應(yīng)用的要求［8］，因此簡單易行的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法更為實用。

本研究采用無飼養(yǎng)層iPSCs培養(yǎng)體系建立人iPSCs系，并對獲得的iPSCs進(jìn)行鑒定，從而為iPSCs的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實驗材料

1.細(xì)胞：人iPSCs購自于北京賽貝生物技術(shù)有限公司。

2.主要試劑：人iPSCs無飼養(yǎng)層基礎(chǔ)培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加劑及解凍完全培養(yǎng)基（PSCeasy，北京）；乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亞砜（DMSO）、堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（Sigma，美國）；玻璃粘連蛋白（Vitronectin XF）試劑盒（Stem cell，加拿大）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（Azanno Biotech，瑞典）；Trizol（Invitrogen，美國）；Nanog兔抗人一抗、SSEA-1小鼠抗人一抗、Sox2小鼠抗人一抗（博奧森，中國）；FITC兔抗小鼠二抗（博士德，中國）；牛血清白蛋白（BSA）、4%多聚甲醛（谷歌，中國）；磷酸緩沖鹽（PBS）粉（奧斯丹，中國）；抗熒光淬滅劑（碧云天，中國）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)方法

（一）培養(yǎng)皿的包被

在細(xì)胞復(fù)蘇或傳代的前一天進(jìn)行培養(yǎng)皿包被。Vitronectin XF即配即用，濃度為10 μg/ml，每個培養(yǎng)皿中加入3 ml至完全覆蓋培養(yǎng)皿底部，4℃冰箱中靜置過夜備用。

（二）配制培養(yǎng)基

于4℃冰箱中解凍基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加劑，離心后混勻，分裝。將添加劑加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制成iPSCs完全培養(yǎng)基，每0.7 ml添加劑與50 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合。人iPSCs解凍完全培養(yǎng)基可在4℃冰箱中直接解凍備用。

（三）人iPSCs的培養(yǎng)

1.復(fù)蘇：37℃水浴鍋中解凍細(xì)胞，劇烈晃動凍存管使凍存液融化至剩余小塊冰晶，迅速取出。用75%酒精消毒凍存管，迅速轉(zhuǎn)移至無菌操作臺。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有2 ml iPSCs解凍完全培養(yǎng)基的15 ml離心管中，輕柔吹打2次。室溫下，200×g離心5 min。棄上清，加入3 ml解凍完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次輕柔吹吸2次，接種到Vitronectin XF包被的培養(yǎng)皿中。顯微鏡下觀察細(xì)胞呈4～20個細(xì)胞大小的團(tuán)塊。水平十字晃動培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布。細(xì)胞于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，更換iPSCs解凍完全培養(yǎng)基為iPSCs完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.傳代：當(dāng)iPSCs克隆融合80%或者克隆中央細(xì)胞生長不良時按1∶3傳代。吸棄培養(yǎng)皿中的iPSCs完全培養(yǎng)基，用不含鈣鎂的PBS溶液洗滌1次。加入0.5 mmol/L的EDTA溶液至完全覆蓋培養(yǎng)皿底面，培養(yǎng)箱中37℃孵育4～5 min，顯微鏡下觀察到克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)間隙但尚未完全分離，細(xì)胞皺縮成類圓形時，可終止消化。輕柔吸棄EDTA溶液，加入完全培養(yǎng)基，輕柔吹打培養(yǎng)皿中貼附的細(xì)胞集落使其脫落，制成4～20個細(xì)胞大小的懸液，加入新的Vitronectin XF包被的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.凍存：完全培養(yǎng)基和DMSO按9∶1的體積比配制凍存液，置于4℃冰箱中備用。吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，無鈣鎂的PBS溶液輕柔洗滌1次。加入0.5 mmol/L的EDTA溶液至完全覆蓋培養(yǎng)皿底面，培養(yǎng)箱中37℃孵育4～5 min，顯微鏡下觀察到克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)間隙但尚未完全分離，細(xì)胞皺縮成類圓形，可終止消化，輕柔吸棄EDTA溶液，即刻加入4℃的凍存液1 ml，輕柔吹打培養(yǎng)皿貼附的干細(xì)胞集落使其脫落，制成4～20個細(xì)胞大小的干細(xì)胞懸液，將凍存細(xì)胞放入程序性凍存盒，于-80℃冰箱中過夜后置入液氮中長期保存。

三、iPSCs的鑒定

（一）PCR檢測基因表達(dá)

取克隆邊緣清晰、生長狀態(tài)良好的iPSCs，Trizol裂解細(xì)胞抽提總RNA，隨機(jī)引物（表1）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測多能性基因SSEA-1、Nanog、Sox2的表達(dá)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸10 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。將擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，每個指標(biāo)設(shè)3個復(fù)孔。

（二）免疫組化染色及免疫熒光鑒定

1.ALP染色：將iPSCs置于12孔板中培養(yǎng)，形成典型iPSCs克隆后進(jìn)行ALP染色，染色步驟及方法參照ALP染色試劑盒。

2.免疫熒光：將iPSCs置于Vitronectin XF包被的細(xì)胞爬片上進(jìn)行培養(yǎng)。待形成典型的iPSCs克隆后，用5%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。1%BSA溶液封閉2 h，吸棄封閉液后加入按1∶50稀釋的SSEA-1小鼠抗人一抗，將爬片置入4℃冰箱過夜。吸棄一抗，PBS洗滌3次，每次5 min，再加入按1∶100稀釋的FITC兔抗小鼠二抗，室溫孵育2 h。吸棄二抗，PBS溶液洗滌3次，每次5 min。再加入DAPI染核5 min，吸棄DAPI，PBS洗滌3次，每次5 min。于載玻片上滴20 μl抗熒光淬滅劑，將細(xì)胞爬片置于熒光顯微鏡下觀察。采用相同的步驟及一抗、二抗?jié)舛葘anog和Sox2進(jìn)行熒光檢測。

表1　PCR引物

結(jié)果

一、iPSCs的生長

iPSCs克隆呈橢圓形或者圓形，克隆邊界清晰，折光性較好?？寺?nèi)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞胞體較小，增殖旺盛。培養(yǎng)3～4 d后可見克隆增大，克隆間可發(fā)生接觸融合（圖1）。

二、iPSCs的鑒定

iPSCs經(jīng)過多次傳代后，PCR檢測結(jié)果顯示其仍高表達(dá)多能性基因SSEA-1、Nanog、Sox2（圖2）。通過ALP組化染色，可見染色陽性（圖3）。SSEA-1、Nanog、Sox2免疫熒光檢測結(jié)果顯示陽性（圖4～6），表明人iPSCs具有良好的多能性。

討論

iPSCs是由日本學(xué)者Takahashi等［1］首次借助4個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）重編程成纖維細(xì)胞而獲得。

早期ESC及iPSCs的培養(yǎng)方法均添加胎牛血清，由于其成分復(fù)雜，且不同批次血清的質(zhì)量不均一，會給細(xì)胞培養(yǎng)帶來不確定的影響因素［8］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在維持iPSCs多能性的前提下對iPSCs的培養(yǎng)體系及方法進(jìn)行了不斷探索［9，10］。通過簡化培養(yǎng)步驟，減少外源性動物蛋白添加，明確培養(yǎng)液的化學(xué)成分等方式優(yōu)化其培養(yǎng)體系，使得無飼養(yǎng)層、化學(xué)成分明確的iPSCs培養(yǎng)方法得以應(yīng)用和發(fā)展［8，10-12］。

Vitronectin為人血漿中的一種糖蛋白，濃度為200～400 μg/ml時，促進(jìn)細(xì)胞黏附，對于調(diào)控細(xì)胞遷移/侵蝕、增殖及組織修復(fù)均具有重要作用［13］。本研究中所用的Vitronectin XF為重組人源蛋白，不僅能為iPSCs培養(yǎng)提供成分明確的持久培養(yǎng)環(huán)境，而且容易獲取，價格低廉［10，14］。EDTA消化傳代，較膠原酶、胰酶消化的方式更加溫和，對iPSCs損傷小，更易獲得大小合適的細(xì)胞團(tuán)塊［10］。本研究所用的iPSCs完全培養(yǎng)基為E8改良型培養(yǎng)基。E8培養(yǎng)基在mTeSR1培養(yǎng)體系中去除了β-巰基乙醇及BSA，含有8種明確化學(xué)成分，所含蛋白均為人重組蛋白［10］，具有化學(xué)成分明確、無動物源成分、支持無飼養(yǎng)層培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)可獲得典型的iPSCs克隆，細(xì)胞多能性指標(biāo)高表達(dá)，具有向3個胚層細(xì)胞分化的能力［10］；明確簡單的成分避免了對實驗因子和藥物作用的干擾，同時可保證不同批次培養(yǎng)基的一致性和質(zhì)量穩(wěn)定性，提高實驗的可重復(fù)性［15］。

圖1　iPSCs的生長狀況（×100） a：復(fù)蘇后第1天，克隆形成；b：復(fù)蘇后第2天，克隆增大，邊緣清晰；c：復(fù)蘇后第3天，克隆出現(xiàn)接觸融合；d：復(fù)蘇后第4天的iPSCs克隆

圖2　PCR檢測多能性基因表達(dá)，每個指標(biāo)3個復(fù)孔，可見SSEA-1、Nanog、Sox2高表達(dá)

圖3　ALP染色結(jié)果（×100） a：未行ALP染色的iPSCs克??；b：ALP染色后的iPSCs克隆

圖4　SSEA-1免疫熒光染色（×100） a：DAPI染色；b：SSEA-1熒光染色陽性；c：DAPI/SSEA-1融合圖像

圖5　Nanog免疫熒光染色（×100） a：DAPI染色；b：Nanog熒光染色陽性；c：DAPI/Nanog融合圖像

圖6　Sox2免疫熒光染色（×100） a：DAPI染色；b：Sox2熒光染色陽性；c：DAPI/Sox2融合圖像

本研究為鑒定無飼養(yǎng)層培養(yǎng)獲得的iPSCs，通過PCR及免疫熒光鑒定了多潛能干細(xì)胞特異性標(biāo)記物SSEA-1、Nanog、Sox2。SSEA-1即CD15，由Solter等［16］發(fā)現(xiàn)，為階段特異性胚胎抗原之一；Nanog基因可維持ESC的自我更新及全能型［17］，iPSCs高表達(dá)該基因證實其具有與ESC類似的多潛能性；Sox2是Sox區(qū)域Y相關(guān)高遷移率蛋白超家族的成員之一，在維持ESC自我更新和多潛能性中具有重要作用［18］。

本研究尚未進(jìn)行后續(xù)的3個胚層分化驗證及畸胎瘤形成實驗，但通過本研究獲得了穩(wěn)定的iPSCs系，從而為后續(xù)誘導(dǎo)iPSCs向不同組織細(xì)胞分化的研究提供了研究基礎(chǔ)。

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Feeder-free culture and identification of human induced pluripotent stem cells.

WANG Huan，F(xiàn)ANG Huang，LI Xiao，GAO Shutao，ZHOU Chuankun，ZOU Yinshuang，LI Feng.Department of Orthopaedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

FANG Huang，E-mail:fanghuangtjh@126.com

ObjectiveTo explore a stable feeder-free culture system of induced pluripotent stem cells （iPSCs）and identify iPSCs cultured through feeder-free system.MethodsiPSCs were plated on the dish which was coated with Vitronectin XF，and passaged by EDTA solution.Morphology of iPSCs was observed under a microscope，and the pluripotency marker ALP，was analyzed.Moreover，the pluripotent genes SSEA-1，Nanog and Sox2 were detected by PCR and inmunofluorescence.ResultsiPSCs formed typical cell clones with clear boundary，and the clones were round or oval.The immunohistochemistry of ALP showed positive reaction.PCR showed that pluripotent genes SSEA-1，Nanog and Sox2 were expressed strongly.Moreover，the immunoinfluorescence analysis of SSEA-1，Nanog and Sox2 revealed positive results.ConclusionFeeder-free iPSCs culture system provides suitable condition for keeping iPSCs proliferation and pluripotency.

Pluripotent stem cells；Cell culture techniques；Feeder-free

10.3969/j.issn.1674-8573.2016.01.012

國家自然科學(xué)基金資助項目（81271347）

430030武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科

方煌，E-mail：fanghuangtjh@126.com

2015-06-16）