糜寶國　關(guān)邯峰　劉常宇　雷琢瑋　宋超　劉慧勇　鄧杝　熊偉　廖暉　方忠　李鋒

·實驗研究論著·

不同濃度地西他濱對破骨細胞分化的影響

糜寶國關(guān)邯峰劉常宇雷琢瑋宋超劉慧勇鄧杝熊偉廖暉方忠李鋒

目的探討不同濃度梯度地西他濱對破骨細胞形成、活性及吸收功能的影響。方法不同濃度地西他濱（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）處理單核巨噬（RAW264.7）細胞。通過4’，6?聯(lián)瞇?2?苯基吲哚（4，6?Diamidino?2?phenylindole dihydrochloride，DAPI）染色和微絲綠色熒光探針（F?actin?Trakcer Green）染色后觀察F?actin環(huán)的形成即破骨細胞輪廓；抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒檢測細胞上清中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性，骨板吸收實驗檢測破骨細胞的骨吸收能力；Q?PCR實驗檢測破骨細胞標志基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CK）和脊髓基質(zhì)金屬蛋白酶?9（matrix metalloproteinase?9，MMP?9）的mRNA表達。結(jié)果不同濃度地西他濱抑制核因子NF ?κB配體激活因子（receptor activator of NF?κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)RAW264.7細胞形成F?actin環(huán)，降低了破骨細胞的TRAP酶活性，抑制了破骨細胞的骨吸收能力，同時也下調(diào)了破骨細胞標志基因TRAP、CK和MMP?9的mRNA表達。且隨著藥物濃度的增高，上述的抑制作用越明顯。結(jié)論地西他濱抑制破骨細胞形成、活性和骨吸收能力，且這種抑制作用隨著藥物濃度的增加而逐漸增強。

破骨細胞；細胞分化；RNA干擾

骨重塑過程是通過成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收的循環(huán)來實現(xiàn)的。破骨細胞來源于骨髓單核巨噬細胞系，由多核巨噬細胞組成，在人體生理性骨重建和病理性骨破壞過程中發(fā)揮著重要作用［1，2］。

近年來，隨著對破骨細胞分化調(diào)控機制的認識加深，NF?κB配體激活因子（receptor activator of NF?κB ligand，RANKL）在破骨細胞分化、成熟和活化過程中的作用備受關(guān)注。RANKL/NF?κB受體激活因子（receptor activator of NF?κB，RANK）/護骨素（osteo?protegerin，OPG）通路在骨代謝中起到主要調(diào)控作用［3，4］。

地西他濱（decitabine）是一種DNA去甲基化藥物，可以逆轉(zhuǎn)DNA過度甲基化，使因過度甲基化而致緘默的基因重新表達［5］。基因組甲基化水平在造血干細胞中最高，分化過程中甲基化水平逐漸降低。尤其是向髓系分化時，基因組的DNA甲基化產(chǎn)生了巨大的改變。由于地西他濱可促進急性髓細胞白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）細胞分化［6］。破骨系細胞屬于髓系細胞，起源于造血干細胞，所以基于以上研究結(jié)果，我們猜測地西他濱可能在破骨細胞發(fā)生和功能中起著一定的作用。

我們通過前期實驗研究發(fā)現(xiàn)地西他濱可以抑制破骨細胞的分化、形成和功能，同時也闡述了地西他濱抑制破骨分化的相關(guān)分子機制［7］。然而，前期的實驗中未明確表明不同濃度地西他濱對破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant acid phospha?tase，TRAP）酶活性和骨板吸收實驗的影響，也未闡述不同濃度地西他濱對破骨細胞F?actin環(huán)形成的影響。因此，本次實驗基于前期實驗的研究基礎(chǔ)之上，選取了安全有效的藥物濃度，即不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）的地西他濱［7］。本文旨在進一步闡述不同濃度地西他濱對破骨細胞F?actin環(huán)形成的影響，以及明確不同濃度梯度地西他濱對破骨細胞TRAP酶活性和骨吸收能力的影響。

材料與方法

一、試劑與材料

胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、D?MEM培養(yǎng)基分別購自美國Gibco和HyClone公司。RAW264.7細胞購自中國科學(xué)院細胞庫，重組小鼠RANKL來源于美國R&D公司。地西他濱購于美國BioVision公司，聚苯乙烯骨表面分析微孔板購自美國Corning公司。4’，6?聯(lián)瞇?2?苯基吲哚（4，6?diamidino?2?phenyl?indole dihydrochloride，DAPI）、微絲綠色熒光探針（F ?actin?Trakcer Green）試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)公司。

二、細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

37℃含5%CO2濕化空氣培養(yǎng)箱中，用含體積分數(shù)10%胎牛血清，100 μ/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)單核巨噬（RAW264.7）細胞。待細胞長滿瓶底的80%左右時進行傳代培養(yǎng)，每3天換1次液。

RAW264.7細胞是破骨細胞前體細胞，在誘導(dǎo)因子RANKL的誘導(dǎo)作用下可向破骨細胞分化。將RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后待細胞完全貼壁生長穩(wěn)定后，用50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔1 d更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基1次。誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后在鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)多個RAW264.7細胞相互融合，形成了多核細胞（核數(shù)≥3）。

三、F?actin環(huán)的形成和DAPI染色

RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種在96孔板中，待細胞生長穩(wěn)定完全貼壁后，分別用不同濃度地西他濱（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L、）處理24 h后更換培養(yǎng)液。50 ng/mL RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后根據(jù)說明書染色步驟行F?actin熒光染色和DAPI熒光染色。最后置于熒光顯微鏡下拍照分析。

四、抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測

RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種在96孔板中，待細胞生長穩(wěn)定完全貼壁后，分別用不同濃度地西他濱（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）處理24 h后更換培養(yǎng)液。50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后用TRAP檢測試劑盒檢測細胞上清中TRAP酶的活性。實驗方法采用李勇等［8］所述，步驟如下：將96孔板中的細胞用PBS沖洗2次，用1%的Triton?100裂解細胞30 min；充分裂解后，移入到EP管中，離心收集上清液；分別設(shè)置空白對照、標準品和樣品組，空白組依次加入檢測緩沖液、顯色底物和酒石酸溶液。標準品組依次加入檢測緩沖液、酒石酸溶液和標準品工作液；樣品組依次加入檢測緩沖液、顯色底物、酒石酸溶液和樣品；用槍頭吹打混勻后37℃孵育30 min；每孔加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，于405 nm測定吸光度。

五、骨板吸收實驗

將RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種于聚苯乙烯骨表面分析微孔板中，用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d待破骨細胞形成后［7，9］，用不同濃度地西他濱（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）處理24 h，然后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)用50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，使得分化成熟的破骨細胞充分發(fā)揮其骨吸收能力。最后用漂白液洗去培養(yǎng)板上的細胞，待骨表面分析微孔板干燥后在倒置顯微鏡下觀察骨陷窩形成情況并拍照，Image?pro plus6.0圖像分析軟件對圖像進行分析。

六、總mRNA的提取及Q?PCR檢測

將RAW264.7細胞接種在6孔板中，待細胞完全貼壁，生長穩(wěn)定后用不同濃度地西他濱（0、0.1、0.25 和0.5 μmol/L）處理24 h后更換培養(yǎng)液。50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后用提取總RNA，合成cDNA用于Q?PCR檢測。

Q?PCR實驗中所用引物序列如下：

1.TRAP上游引物：5′?GATGCCAGCGA?CAAGAGGTT?3′，下游引物：5′?CATACCAGGGGAT?GTTGCGAA?3′。

2.組織蛋白酶K（cathepsin K，CK） 上游引物：5′?GAAGAAGACTCACCAGAAGCAG?3′，下游引物：5′?TCCAGGTTATGGGCAGAGATT?3′。

3.脊髓基質(zhì)金屬蛋白酶?9（matrix metallopro?teinase?9，MMP?9） 上游引物：5′?CTGGACAGC?CAGACACTAAAG?3′，下游引物：5′?CTCGCG?GCAAGTCTTCAGAG?3′。

4.β?actin上游引物：5′?ATTTCTGAATGG?CCCAGGT?3′，下游引物：5′?CTGCCTCAACACCT? CAACC?3′。

反應(yīng)體系（總體積10 μl）：引物0.5 μl，2×Trans Start Green Mix 5 μl，模板（cDNA）0.5 μl，DEPC水4 μl。

反應(yīng)條件為95℃30 min，1個循環(huán)；95℃2 s，60℃30 s，40個循環(huán)。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0（SPSS公司，美國）統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，所有數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用單因素方差分析ANOVA和SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1　F?actin環(huán)染色　不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱處理RAW264.7細胞，經(jīng)RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)后行F?actin染色和DAPI染色，可見：與地西他濱濃度為0 μmol/L組相比，濃度為0.1 μmol/L時，F(xiàn)?actin環(huán)的大小和數(shù)目無明顯差異；濃度為0.25 μmol/L和0.5 μmol/L時，形成的F?actin環(huán)較小，并且數(shù)目明顯減少

結(jié)果

一、F?actin和DAPI熒光染色

不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱處理RAW264.7細胞24 h，經(jīng)50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后行F?actin綠絲熒光染色可見（圖1）：與地西他濱濃度為0 μmol/L組相比，當(dāng)濃度為0.1 μmol/L時，F(xiàn)?actin環(huán)的大小和數(shù)目無明顯差異；濃度為0.25 μmol/L和0.5 μmol/L時，形成的F?actin環(huán)較小，并且數(shù)目明顯減少；隨著地西他濱濃度的增加，F(xiàn)?actin環(huán)的輪廓逐漸減小，數(shù)目逐漸減少，即地西他濱對破骨細胞F?actin環(huán)形成的抑制作用呈劑量依賴性。

二、TRAP活性檢測

TRAP檢測試劑盒檢測酶活性結(jié)果顯示（圖2）：與地西他濱濃度為0 μmol/L組相比，當(dāng)濃度為0.1、0.25和0.5 μmol/L時，TRAP酶在405 nm處測定的吸光度（A405）逐漸降低。吸光度越高表示TRAP酶活性越強。0.1 μmol/L組、0.25 μmol/L組和0.5 μmol/L組與0 μmol/L組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

三、骨板吸收實驗

破骨細胞接種到骨板上后骨吸收的情況顯示被吸收的地方呈蠶食樣改變（圖3）。0 μmol/L地西他濱組中可見明顯的骨陷窩形成；0.1 μmol/L組中骨陷窩稍有減少；0.25 μmol/L組和0.5 μmol/L組中的骨陷窩明顯減少。

0.25 μmol/L組、0.5 μmol/L組分別與0 μmol/L地西他濱組的骨板吸率（不同濃度地西他濱組的骨吸收陷窩面積百分比）相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

四、Q?PCR實驗

不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱處理RAW264.7細胞，經(jīng)RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)后行破骨細胞標志基因的mRNA檢測。Q?PCR結(jié)果示（圖5）：當(dāng)?shù)匚魉麨I濃度為0.1、0.25、0.5 μmol/L時與0 μmol/L組相比，TRAP、CK和MMP?9的mRNA表達量逐漸降低。0.25 μmol/L組、0.5 μmol/L組分別與0 μmol/L組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

討論

圖2　TRAP酶活性檢測　不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱處理RAW264.7細胞，經(jīng)RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)后行TRAP酶活性檢測：0.1、0.25、0.5 μmol/L組與0 μmol/L組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均*P＜0.05）

圖3　骨板吸收實驗　不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱處理RAW264.7細胞，經(jīng)RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)后行骨板吸收實驗檢測：0 μmol/L組中可見明顯的骨陷窩形成；0.1 μmol/L組中骨陷窩稍有減少；0.25 μmol/L組和0.5 μmol/L組中的骨陷窩明顯減少

圖4　骨板吸率　不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱組的骨吸收陷窩面積百分比：0.25 μmol/L組、0.5 μmol/L組分別與0 μmol/L組骨板吸率相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）

圖5　Q?PCR實驗　不同濃度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他濱處理RAW264.7細胞，經(jīng)RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)后行破骨細胞標志基因的mRNA檢測：0.25 μmol/L組、0.5 μmol/L組分別與0 μmol/L組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均*P＜0.05）

破骨細胞是骨組織特異性的多核巨噬細胞，由造血干細胞經(jīng)由單核-巨噬細胞前體細胞分化而來。破骨細胞與成骨細胞共同參與骨代謝的調(diào)節(jié)，對骨代謝平衡的維持起著至關(guān)重要的作用［10］。RAW264.7細胞是破骨前體細胞，具有易培養(yǎng)、可無限傳代和穩(wěn)定性好等優(yōu)點。與破骨前體細胞相比，破骨細胞主要具有以下特點：①細胞形態(tài)較大、核多；②可生成多種特異性蛋白，包括TRAP、CK和MMP?9等［11］；③具有骨吸收功能。TRAP染色和TRAP酶活性檢測時檢測破骨細胞形成和活性的常規(guī)實驗方法，通過骨板吸收實驗檢測破骨細胞的吸收功能。然而F?actin和DAPI熒光染色也可以用于觀察破骨細胞的形態(tài)和輪廓。在本研究中，通過F?actin和DAPI熒光染色觀察破骨細胞形態(tài)和輪廓的變化、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒檢測TRAP活性間接反映破骨細胞活性、通過骨板吸收實驗以及Q?PCR等方法來評價不同濃度地西他濱對破骨細胞分化的影響。結(jié)果從形態(tài)特征、破骨細胞活性和功能狀況等方面均證明了地西他濱對破骨細胞形成、活性及功能的影響呈藥物劑量依賴性。

地西他濱是一種DNA甲基化抑制劑，目前在臨床上主要用于治療骨髓增生異常綜合征和急性髓細胞白血病等惡性血液系統(tǒng)疾病。地西他濱通過抑制MYC基因的表達而發(fā)揮抗腫瘤的作用［12］。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)地西他濱可以抑制RAW264.7細胞向破骨細胞分化。本次研究基于前期實驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上，選用了安全有效的藥物濃度，觀察了不同藥物濃度對破骨細胞形成、活性和功能的影響。實驗結(jié)果進一步明確了地西他濱對破骨細胞分化的抑制作用，且這種抑制作用呈藥物劑量依賴性表現(xiàn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明不同濃度地西他濱對破骨細胞F?actin環(huán)的形成、破骨細胞活性和破骨細胞吸收功能的抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系。

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Effect of different concentrations of decitabine on osteoclast differentiation.

MI Baoguo，GUAN Hanfeng，LIU Changyu，LEI Zhuowei，SONG Chao，LIU Huiyong，DENG Yi，XIONG Wei，LIAO Hui，F(xiàn)ANG Zhong，LI Feng.Department of Orthopaedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

LIFeng，E?mail：lifengmd@hust.edu.cn；FANGZhong，E?mail：zhongfangtjh@yahoo.com

ObjectiveTo explore the effect of different concentrations of decitabine on osteoclast for?mation，activity and osteoclasts resorptive capacity.MethodsRAW264.7 cells were treated with decitabine at different concentrations（0，0.1，0.25，0.5 μmol/L）.Osteoclast differentiation was assessed by DAPI and F?actin?Trakcer Green staining tests.Tartrate?resistant acid phosphatase kit was used to evaluate TRAP activity.Osteo?clasts resorptive capacity was detected by bone resorption test.The expression of osteoclast specific genes like TRAP，capthesin K，and MMP?9 mRNA was detected by RT?PCR.ResultsDifferent concentrations of decitabine inhabited RANKL?stimulated osteoclastogenesis in RAW264.7 cell culture，as manifested by de?crease of F?actin rings formation，TRAP activity and osteoclasts resorptive capacity in a dose?dependent man?ner，and also down?regulated TRAP，CK，and MMP?9 mRNA expression.ConclusionDecitabine inhabited os?teoclast formation，activity and osteoclasts resorptive capacity in a dose?dependent manner.

Osteoclasts；Differentiation；RNA interference

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.02.012

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金資助（2014TS074）；湖北省自然科學(xué)基金（2014CFB196）

430030武漢，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院骨科

李鋒，E?mail：lifengmd@hust.edu.cn；方忠，E?mail：zhong?fangtjh@yahoo.com

（2015?09?03）