胡楊　覃巍　廉凱　晏雄偉　陸新顏

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

內(nèi)源性硫化氫及其合成酶在人成骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的研究

胡楊覃巍廉凱晏雄偉陸新顏

目的觀察硫化氫（H2S）及其合成酶胱硫醚?β?合成酶（CBS）、胱硫醚?γ?裂解酶（CSE）和3?巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（MPST）在人成骨細(xì)胞株及人成骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。方法我科于2013年6月至2014年12月運(yùn)用免疫組化染色和蛋白質(zhì)印跡方法在人永久性成骨細(xì)胞株hFOB1.19，成骨肉瘤細(xì)胞株Saos?2、MG?63和U?2 OS中分別檢測(cè)CBS、CSE和MPST基因表達(dá)量、蛋白含量；通過(guò)敏感硫電極法檢測(cè)H2S在正常成骨組織和骨肉瘤細(xì)胞中的含量。分別比較H2S及其合成酶在各組之間的差異，初步探討H2S及其合成酶與不同成骨肉瘤細(xì)胞之間的關(guān)系。結(jié)果在成骨肉瘤標(biāo)本和細(xì)胞中CBS、CSE和MPST基因的較高表達(dá)；成骨肉瘤組織與成骨細(xì)胞來(lái)源的正常和惡性腫瘤細(xì)胞CBS、CSE和MPST基因表達(dá)的蛋白水平以及H2S產(chǎn)生率不同，其中成骨肉瘤細(xì)胞株U?2 OS表達(dá)水平最高。結(jié)論內(nèi)源性H2S及它的合成酶CBS、CSE和MPST存在于人惡性成骨肉瘤組織和細(xì)胞中，高水平的H2S及其生物合成物質(zhì)或許能成為成骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)。

硫化氫；骨肉瘤；成骨細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

成骨肉瘤占所有惡性腫瘤的比例不到1%，是最常見(jiàn)的骨惡性腫瘤，在兒童和青少年中多見(jiàn)［1，2］。盡管聯(lián)合了外科和其他治療方法，大部分患者后來(lái)仍會(huì)復(fù)發(fā)并最終死于肺轉(zhuǎn)移［3］?；陧樸K新的輔助化療方法是治療進(jìn)展期轉(zhuǎn)移性成骨肉瘤的唯一方法，起初療效良好，隨后會(huì)出現(xiàn)固有的或獲得性順鉑耐藥而使治療失敗［4］。研究表明多重機(jī)制導(dǎo)致順鉑耐藥性的產(chǎn)生，包括藥量攝入的減少和/或流出的增加，含硫蛋白和/或分子的失活，DNA包含修復(fù)和/或耐受能力的增加，以及凋亡啟動(dòng)的失效［5］。順鉑反應(yīng)性的抑制和逆轉(zhuǎn)是核心部分，因其耐藥和致死性結(jié)局的高發(fā)，需要更有力的研究進(jìn)行證實(shí)。

在哺乳類動(dòng)物中，硫化氫（H2S）是一種新近發(fā)現(xiàn)的由β胱硫酸合成酶（CBS）、γ胱硫酸裂解酶（CSE）和3?巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（MPST或3?MST）三種酶催化產(chǎn)生的內(nèi)生性氣體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子［6］。盡管骨骼系統(tǒng)中內(nèi)源性H2S的表達(dá)和功能尚未完全清楚，一些研究表明H2S能參與破骨細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞的分化以及成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)［7，8］。

骨腫瘤的形成中，包括氣體信號(hào)分子在內(nèi)的各種因子參與此進(jìn)程，從而產(chǎn)生相應(yīng)的病理表現(xiàn)［9，10］。新型氣體信號(hào)分子H2S在骨來(lái)源細(xì)胞中所起的作用，目前國(guó)際上僅見(jiàn)Irie等［11］觀察到外源性給予H2S可引起大鼠牙槽骨中破骨細(xì)胞的成骨性分化，而最為重要的H2S在正常以及惡性骨來(lái)源組織和細(xì)胞中的表達(dá)以及可能的功能情況仍未見(jiàn)報(bào)道。

我們假設(shè)增加H2S含量和其生物合成或許能在成骨肉瘤中起作用，通過(guò)體外直接增加H2S供體NaHS含量或抑制內(nèi)源性H2S生物合成，在人正常成骨細(xì)胞hFOB1.19和人成骨肉瘤細(xì)胞U?2 OS中，它們?cè)鲋澈偷蛲龅拿黠@變化。本項(xiàng)研究致力于在人成骨肉瘤標(biāo)本和培養(yǎng)細(xì)胞中識(shí)別H2S的產(chǎn)生能力和CBS、CSE和MPST基因的蛋白表達(dá)水平。本項(xiàng)研究目的在于：①在人成骨肉瘤標(biāo)本和培養(yǎng)細(xì)胞中識(shí)別H2S的產(chǎn)生能力和CBS、CSE和MPST基因的蛋白表達(dá)水平，探討在骨腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，H2S的表達(dá)以及功能意義；②研究H2S在其增殖和凋亡過(guò)程中的潛在作用，探討其在成骨肉瘤治療中成為新的藥物靶點(diǎn)的可能。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人永久性成骨細(xì)胞株hFOB1.19（CRL?11372）、成骨肉瘤細(xì)胞株Saos?2（HTB?85）、MG?63（CRL?1427）和U?2 OS（HTB?96）從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)獲得。hFOB1.19細(xì)胞株在去除了苯酚紅的DMEM （HyClone，Thermo Fish Scientific公司，美國(guó)）與F12 按1∶1混合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Saos?2細(xì)胞株常規(guī)在McCoy’s 5a培養(yǎng)基（HyClone）中培養(yǎng)，MG?63細(xì)胞株常規(guī)在Eagle’s Minimum Essential Medium（Invitrogen公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，U?2 OS細(xì)胞株常規(guī)在McCoy’s 5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清（FBS，Invitrogen公司，美國(guó)），100 U的青霉素G和100 μg鏈霉素（Lonza Group公司，瑞士）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）組織標(biāo)本和細(xì)胞CBS、CSE和MPST基因免疫組化染色和圖像的半定量檢測(cè)

將4 μm厚石蠟包埋切片用3%過(guò)氧化氫處理15 min后，再用標(biāo)準(zhǔn)山羊血清孵育30 min，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。接著進(jìn)行再補(bǔ)水過(guò)程，用微波爐讓組織切片在四乙銨二乙酸鈉（EDTA）緩沖液中沸騰10 min，進(jìn)行抗原恢復(fù)。切片CBS（Abnova，中國(guó)臺(tái)灣）、CSE（Abnova，中國(guó)臺(tái)灣）和MPST（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）基因檢測(cè)一抗于4℃冰箱用1∶200的鼠抗人抗體孵育12 h。PBST漂洗后，二抗用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體孵育（Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)），二抗由過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素以及二氨基聯(lián)苯胺配制，并用蘇木精進(jìn)行對(duì)比染色。每例標(biāo)本選取10張連續(xù)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)圖像半定量檢測(cè)，通過(guò)MSTS評(píng)分系統(tǒng)及Enneking肌肉骨骼系統(tǒng)腫瘤術(shù)后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和特異性染色強(qiáng)度進(jìn)行分組。染色強(qiáng)度陰性記為“-”，中等記為“+”，強(qiáng)染色記為“++”。

切片上的U?2 OS細(xì)胞用PBS沖洗2次后，在PBS緩沖液中用4%多聚甲醛固定30 min，然后室溫下用滲透液（BD Pharmingen公司，美國(guó)）處理5 min。蓋玻片于4℃用一抗孵育12 h，再用1∶50的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）抗鼠二抗（Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)）于37℃孵育1 h。切片DAPI處理后用激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）獲取圖像。

（二）蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)細(xì)胞中蛋白含量

成骨肉瘤細(xì)胞置于人胚肺成纖維細(xì)胞（WI?38）的裂解產(chǎn)物（Abnova）中，用Bradford蛋白法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，CBS、CSE和MPST基因的表達(dá)水平通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（Bio?Rad Life Science公司，美國(guó)）電泳，每條泳道加載100 μg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封膜，用1∶1 000鼠抗人CBS、CSE和MPST抗體，α微管蛋白抗體（Abnova，中國(guó)臺(tái)灣）孵育，然后用辣根過(guò)氧化酶二抗（Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)）孵育。ECL免疫印跡試劑盒（Promega公司，美國(guó)）監(jiān)測(cè)信號(hào)，并用柯達(dá)成像系統(tǒng)（Eastman Kodak公司，美國(guó)）記錄。

（三）H2S產(chǎn)生能力分析

成骨肉瘤細(xì)胞均勻分布于10倍于自身體積（wt/ vol）的冰鎮(zhèn)磷酸鉀緩沖液中（pH=6.8）。反應(yīng)在25 ml錐形瓶中進(jìn)行，2 ml試管作為中央井，每管含有1 mol/L NaOH 0.5 ml，硫敏感電極（PXS?270，上海）用于測(cè)定內(nèi)源性H2S產(chǎn)生率，代表產(chǎn)H2S酶的活力［16］。用細(xì)胞勻漿同500 μl預(yù)冷的50 mmol/L pH=6.8 PBS緩沖液和1 ml反應(yīng)系統(tǒng)溶液（100 mmol/L pH=7.4 PBS，10 mmol/L L?cys mmol/L）混合，制備混合液。在樣本蛋白濃度測(cè)定后，取2 ml上述混合液移入室溫下的燒瓶中，密封后37℃水浴90 min。然后加入50%三氯乙酸1 ml結(jié)束反應(yīng)，并繼續(xù)37℃水浴60 min。把中央井中的內(nèi)容物分裝到12支含有1 ml抗氧化劑的試管（Corning公司，美國(guó)）中。隨后，用硫敏感電極測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線下上述試管中的H2S含量，單位nmol/（min·mg）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正常骨組織和成骨肉瘤細(xì)胞中CBS、CSE和MPST基因蛋白表達(dá)水平，H2S產(chǎn)生能力對(duì)比，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

表1 各細(xì)胞涂片CBS、CSE、MPST染色強(qiáng)度

一、成骨肉瘤細(xì)胞中CBS、CSE和MPST基因的表達(dá)

正常成骨細(xì)胞hFOB1.19很少或不表達(dá)CBS、CSE或MPST，成骨肉瘤上皮細(xì)胞表達(dá)CBS和CSE，基質(zhì)細(xì)胞同樣表達(dá)CSE。人成骨肉瘤細(xì)胞株U?2 OS免疫組化染色顯示CBS、CSE及MPST表達(dá)陽(yáng)性（圖1，表1）。

二、成骨肉瘤細(xì)胞中CBS、CSE、MPST基因蛋白表達(dá)水平

正常成骨細(xì)胞組織和成骨肉瘤細(xì)胞CBS，CSE 和MPST基因表達(dá)的蛋白水平不同，與正常成骨細(xì)胞組比較，肉瘤組細(xì)胞CBS、CSE、MPST蛋白含量明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中成骨肉瘤細(xì)胞株U?2 OS表達(dá)水平最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）。

三、H2S產(chǎn)生能力分析

正常成骨細(xì)胞僅產(chǎn)生少量H2S。與正常成骨細(xì)胞組比較，肉瘤組細(xì)胞H2S產(chǎn)率明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中成骨肉瘤細(xì)胞株U?2 OS H2S產(chǎn)率最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2　各細(xì)胞組織CBS、CSE、MPST蛋白定量和H2S產(chǎn)率測(cè)定

表2　各細(xì)胞組織CBS、CSE、MPST蛋白定量和H2S產(chǎn)率測(cè)定

注：與hFOB1.19相比，*P＜0.05；與Saos?2、MG?63相比，△P＜0.05

基因hFOB1.19 Saos?2 MG?63 U?2 OS CBS （nmol/L）0.28±0.07 1.82±0.36*1.96±0.35*2.78±0.65*△CSE （nmol/L）0.34±0.12 2.43±0.64*2.48±0.72*3.67±0.74*△MPSTS （nmol/L）0.38±0.15 2.37±0.45*2.38±0.67*3.82±0.81*△H2S ［nmol/ （min·mg）］10.8±2.25 39.7±3.54*42.2±4.68*53.6±4.37*△

討論

H2S作為人體內(nèi)第三種氣體信號(hào)分子，體內(nèi)由CBS及CSE催化L?半胱氨酸而生成，大量研究表明一碳單位以及含巰基物質(zhì)廣泛參與含巰基物質(zhì)代謝以及藥物轉(zhuǎn)化，而H2S合成途徑位于一碳單位與轉(zhuǎn)硫途徑的關(guān)鍵位置，廣泛參與?SH與?SS?的代謝循環(huán)。H2S具有促進(jìn)血管新生的作用，腫瘤細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)CBS和CSE的合成而增加H2S的合成，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而有體外實(shí)驗(yàn)則表明H2S具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲及誘導(dǎo)凋亡等功能。基于這些證據(jù)，推測(cè)H2S可能與肉瘤的發(fā)病機(jī)制存在關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，同人正常成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，H2S產(chǎn)生能力與其合成酶CBS、CSE和MPST在人惡性成骨肉瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，而且在不同細(xì)胞系中表達(dá)不同，這提示H2S在惡性骨肉瘤發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。

H2S和其生物合成物質(zhì)在人成骨肉瘤中的內(nèi)源特性尚未有研究報(bào)道。H2S被認(rèn)為是一種新的非腎上腺素能和非膽堿能三級(jí)氣體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，并且通過(guò)多重信號(hào)通路發(fā)揮作用，這與一氧化氮和一氧化碳作用機(jī)制不同，盡管它們或許存在交聯(lián)，發(fā)揮協(xié)同或者拮抗作用［9］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，H2S能激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡甚至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［10］。更重要的是，H2S被證明能直接減少和清除ROS和RNS，而ROS和RNS與放化療過(guò)程中的腫瘤形成和分子蛋白、DNA損傷相關(guān)［11，12］。

在心血管炎癥和疾病中，H2S及其合成酶的表達(dá)和功能研究較為深入，目前已有報(bào)道將H2S及其合成酶作為可能的治療靶點(diǎn)。那么外源性H2S在基于順鉑新的輔助化療中的作用需要更進(jìn)一步探索，確認(rèn)是促進(jìn)凋亡或者保護(hù)增殖。研究表明含巰基化合物能減輕順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［13］。我們推測(cè)H2S不僅激活多條信號(hào)通路拯救細(xì)胞，并有可能直接去除順鉑毒性。最近有研究揭示H2S在增加谷胱甘肽（GSH）產(chǎn)量同時(shí)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，這能夠減輕許多藥物和自由基的細(xì)胞毒性［14］。正如在許多順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞［15］中觀察到了谷胱甘肽的超表達(dá)，順鉑耐藥機(jī)制可能歸因于H2S的介入。

新型氣體信號(hào)分子H2S的研究在國(guó)際上也尚處于起步階段，在骨肉瘤方面更是空白，本實(shí)驗(yàn)意義重大，可能為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制及診斷治療探索提供新的研究方向。

圖2　解蛋白印跡結(jié)果表明CBS、CSE及MPST在正常骨細(xì)胞組織中表達(dá)水平較低，而在骨肉瘤細(xì)胞株Saos?2、MG?63和U?2 OS中表達(dá)為陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性

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Expression of endogenous hydrogen sulfide and its synthases in human osteosarcoma cells.

HU Yang，QIN Wei，LIAN Kai，YAN Xiongwei，LU Xinyan.Department of Orthopaedics，Xiangyang Central Hospital，Affili?ated to Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441021，China

QIN Wei，E?mail：tanwhb123@163.com

ObjectiveTo investigate the expression levels of endogenous hydrogen sulfide（H2S）and its synthases cystathionine β?synthase（CBS），cystatbionine γ?lyase（CSE）and 3?mercaptopyruvate sulfurtrans?ferase（MPST）in osteosarcoma cells.MethodsFrom June 2013 to December 2014，immunohistochemistry and Western blotting were used to detect CBS，CSE and MPST mRNA and protein expression in hFOB1.19，Saos?2，MG?63 and U?2 OS cells，and H2S was determined in normal tissue samples and osteosarcoma cells.Re?sultsThere was a higher expression of CBS，CSE and MPST in osteosarcoma samples and cells.The osteosar?coma tissue and osteoblast?derived normal and malignant cell lines presented different protein levels of CBS，CSE and MPST，among which osteosarcoma cancer cells U?2 OS expressed highest.ConclusionH2S and its synthases CBS，CSE，and MPST exist in the human malignant osteoblastic tissues and cells.These findings im?ply that high levels of H2S and its biosynthesis may be a new target for osteosarcoma treatment.

Hydrogen sulfide；Osteosarcoma；Osteoblasts；Apoptosis

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.02.011

湖北省自然科學(xué)基金（2011CDB318）

441021湖北襄陽(yáng)，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院（襄陽(yáng)市中心醫(yī)院）骨科

覃巍，E?mail：tanwhb123@163.com

（2015?06?25）