宋敏，向成玉，丁銀環(huán)，楊葵，吳澤才，林雁，劉靳波（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

·論著·

多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥表型及分子流行病學(xué)調(diào)查研究*

宋敏，向成玉，丁銀環(huán)，楊葵，吳澤才，林雁，劉靳波△
（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

目的探討該院多藥耐藥銅綠假單胞菌（PAE）的耐藥表型及其分子流行病學(xué)特征，為醫(yī)院內(nèi)感染監(jiān)控和制訂感染控制措施提供科學(xué)依據(jù)。方法收集該院2012年9月至2013年2月臨床分離的49株多藥耐藥PAE，采用MicroScan WalkAway 96SI全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)鑒定菌株并獲得對(duì)15種抗菌藥物藥敏結(jié)果。利用基因外重復(fù)回文序列-聚合酶鏈反應(yīng)（REP-PCR）對(duì)PAE進(jìn)行分子分型。結(jié)果49株多藥耐藥PAE，對(duì)亞胺培南的耐藥率最高，為79.6%；對(duì)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、加替沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸的耐藥率在38.8%～65.3%。49株P(guān)AE的遺傳相似性為0.70～1.00，經(jīng)REP-PCR技術(shù)，將49株多藥耐藥PAE分為4型及9個(gè)亞型。結(jié)論該院多藥耐藥PAE耐藥嚴(yán)重并存在克隆傳播流行，及時(shí)實(shí)施醫(yī)院內(nèi)感染的防控策略，能有效預(yù)防多藥耐藥PAE的暴發(fā)和流行。

假單胞菌，銅綠；聚合酶鏈反應(yīng)；藥物耐受性；交叉感染

【Abstract】Objective To investigate the drug resistance phenotype andmoleculare pidemiology characteristics of multidrug resistant pseudomonas aeruginosa（PAE）to provide the scientific basis for controlling the nosocomial infection and formulating the infection controlmea sures.Methods Forty-nine strains of multi-drug resistantPAE in our hospital from September 2012 to February 2013 were collected and identified by the Micro Scan Walk Away 96 SIautomaticmicrobial identification/susceptibility testsystem.The susceptibility results of PAE to 15 kinds ofantibacterial drugswere obtained at the same time.Finally，PAE was performed the molecular typing by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction（REP-PCR）.Results Forty-nine strains of multi-drug resistant PAE had the highest resistance to imipenem（79.6%）；which to gentamicin，amikacin，tobramycin，ceftazidime，ceftriaxone，cefotaxime，cefepime，aztreonam，gatifloxacin，cipr of loxacin，lev of loxacin，piperacillin，piperacillin/me thimazole，ticarcillin/clavulanate was 38.8%-65.3%.Forty-nine isolates of PAE had the genetic similarity of0.70-1.00 and were divided into 4 typesand 9 subtypesby using REP-PCR.Conclusion Multi-drug resistantPAE has serious drug-resistance and the cloned spread exists in our hospital，the timely implementation of hospital infection prevention and control strategies can effectively prevent the outbreaksand prevalence of multi-drug resistant PAE.

【Key words】Pseudomonasaeruginosa；Polymerase chain reaction；Drug tolerance；Cross infection

銅綠假單胞菌（PAE）是引起人類感染的常見(jiàn)條件致病菌之一，可引起皮膚、黏膜、胃腸道、呼吸道等部位的感染，在醫(yī)院內(nèi)感染中占了重要地位。2011年衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)顯示，PAE臨床分離率在非發(fā)酵菌中位居第一［1］。近年來(lái)廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用，PAE株耐藥情況日趨嚴(yán)峻，常呈現(xiàn)多藥耐藥，給臨床抗感染的治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)［2］。本研究對(duì)本院臨床分離的多藥耐藥PAE耐藥表型和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，旨在實(shí)時(shí)監(jiān)控醫(yī)院內(nèi)感染，為臨床合理使用抗菌藥物及制訂醫(yī)院內(nèi)感染控制措施提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源收集本院2012年9月至2013年2月臨床分離的多藥耐藥PAE 49株。菌株分離于血液、痰、咽拭子、分泌物、尿液等標(biāo)本，來(lái)自呼吸內(nèi)科、ICU、燒傷科、神經(jīng)外科、肝膽外科、兒科等科室。質(zhì)控菌株ATCC 27853 PAE和ATCC25922大腸埃希菌。

1.2方法

1.2.1菌株的鑒定及藥敏采用MicroScanWalkAway 96SI全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)鑒定菌株并同時(shí)獲得對(duì)亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、加替沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸15種抗菌藥物的耐藥情況。

1.2.2細(xì)菌DNA的提取將凍存于-80℃的PAE株復(fù)蘇，采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。即挑取適量菌落于懸濁于500μL蒸餾水中，100℃干浴10min，然后12 000 r/min離心5min，上清液即為DNA，應(yīng)用核酸測(cè)定儀將DNA濃度調(diào)為10 ng/μL，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3重復(fù)回文序列-聚合酶鏈反應(yīng)（REP-PCR）擴(kuò)增所用引物參照Versalovic等［3］即REP：5′-IIIGCGCCGICATCAGGC-3′，5′-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3′，優(yōu)化后的反應(yīng)體系：Taq DNA酶1.25U，10×Buffer2.5μL，dNTPs 200μmol/L，模板DNA 80 ng，P1、P2引物各1μmol/L，蒸餾水添加至25μL；優(yōu)化后的擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性3min；90℃變性30 s，45℃退火1min，65℃延伸8min為1個(gè)循環(huán)，循環(huán)次數(shù)35次；最后65℃延伸16min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上成像觀察，并攝像保存。

1.3數(shù)據(jù)分析采用Gel-Pro analyzer分析電泳條帶圖譜，將某條帶存在記為1，不存在記為0，構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYS 2.1e軟件用UPGMA法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，進(jìn)行SAHN聚類分析。

2　結(jié)果

2.1PAE對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況49株多藥耐藥PAE，對(duì)亞胺培南的耐藥率最高，為79.6%；對(duì)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、加替沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸的耐藥率在38.8%～65.3%，見(jiàn)表1。

表1　49株P(guān)AE藥敏結(jié)果

2.2REP-PCR電泳指紋圖譜49株P(guān)AE的指紋條帶數(shù)在5～8條，部分菌株指紋圖譜見(jiàn)圖1。

圖1　REP-PCR擴(kuò)增部分電泳圖

2.3REP-PCR聚類分析結(jié)果49株P(guān)AE的遺傳相似性為0.70～1.00，見(jiàn)圖2。49株P(guān)AE被分為A、B、C、D四大型，A型包括A1、A2亞型，A1亞型包括1、9、10號(hào)菌株，A2亞型包括5、8、49、11、13、16、37、21、33、48號(hào)菌株；B型包括B1、B2亞型，B1亞型包括2、23、47號(hào)菌株。B2亞型包括3、15、46、39號(hào)菌株；C型包括C1、C2亞型，C1亞型包括35號(hào)菌株，C2亞型包括41號(hào)菌株；D型包括D1、D2、D3亞型，D1亞型包括4號(hào)菌株，D2亞型包括17、31、26、30、40、32、18、19、28、25、27、29號(hào)菌株，D3亞型包括6、7、44、42、43、34、12、38、14、45、24、22、20、36號(hào)菌株。

圖2　REP-PCR聚類分析樹(shù)狀圖

3　討論

醫(yī)院內(nèi)感染有較高的發(fā)病率與病死率，嚴(yán)重威脅著患者的預(yù)后和健康。醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)或流行往往是由某種特定細(xì)菌引起，多重耐藥菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染日益嚴(yán)重，已成為醫(yī)院內(nèi)感染控制領(lǐng)域的難題和焦點(diǎn)［4］。多藥耐藥PAE是醫(yī)院內(nèi)感染常見(jiàn)的致病菌，其耐藥率高，耐藥機(jī)制復(fù)雜，易導(dǎo)致交叉感染，常引起醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)與流行［5-7］。通過(guò)分子分型可以對(duì)特殊菌株引起的醫(yī)院內(nèi)感染進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，證實(shí)臨床和流行病學(xué)的假設(shè)，還可用以對(duì)已確認(rèn)的暴發(fā)流行進(jìn)行傳染源追蹤，從而有效預(yù)防再次流行。因此，分子分型技術(shù)在確定感染病原菌、病原菌的親緣性、判定感染的暴發(fā)、尋找感染源等方面起著重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是PCR技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了一系列基于細(xì)菌DNA指紋圖譜的分子生物學(xué)分型方法。REP-PCR以其操作方便、費(fèi)用低廉、不需要特殊儀器設(shè)備、不需要重復(fù)設(shè)計(jì)引物、分辨率高、重復(fù)性和穩(wěn)定性較好、可以進(jìn)行大樣本分析等優(yōu)勢(shì)，便于各層次的醫(yī)院開(kāi)展醫(yī)院內(nèi)感染控制工作。

本研究49株多藥耐藥PAE對(duì)亞胺培南的耐藥率最高（79.6%），對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南耐藥率均在50%以上，以上抗菌藥物考慮不作為首選藥物進(jìn)行抗菌治療。對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、加替沙星、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸耐藥率在38.8%～46.9%，這幾種藥物可作為PAE經(jīng)驗(yàn)治療選擇藥物。隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，多藥耐藥PAE藥株不斷增多，其耐藥性在不同地區(qū)或醫(yī)院之間存在差異［8］。因此，對(duì)本院PAE耐藥進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為臨床第一時(shí)間經(jīng)驗(yàn)用藥提供指導(dǎo)和依據(jù)，對(duì)合理使用抗菌藥物，緩解抗菌藥物選擇性壓力，具有十分重要的意義。

REP-PCR基因分型將49株P(guān)AE分成4型和9個(gè)亞型，每個(gè)亞型內(nèi)的菌株相似性系數(shù)為1，提示各亞型內(nèi)的菌株可能是同一克隆菌株。查閱臨床資料發(fā)現(xiàn)，每個(gè)亞型內(nèi)菌株大多是在同一病房或病區(qū)在同一時(shí)期分離所得，因此可以推斷這些克隆菌株多為醫(yī)院內(nèi)感染。經(jīng)回顧性調(diào)查分析，11、12號(hào)菌株分別于2012年10月5日、2012年10月7日從呼吸內(nèi)科患者痰和腎病內(nèi)科患者尿標(biāo)本中獲得，REP-PCR分型結(jié)果顯示，11、12號(hào)菌株分屬于A型和D型，說(shuō)明這2株菌屬于不同菌株，臨床資料和分型結(jié)果相符。23、26號(hào)菌株分別于2012年11月19日、2012年11月24日從ICU患者痰和分泌物中獲得，雖然這2株菌在同一病房中分離而得，但由于23、26號(hào)菌株分別屬于B型、D型，應(yīng)視為不同分型的菌株。42、43、44號(hào)菌株，分別于2013年1月3日、2013年1月6日和2013年1月9日從ICU室患者痰和尿，以及呼吸內(nèi)科患者分泌物分離而得，這些菌株可能來(lái)源于同一菌株的克隆流行。值得注意的是，這些克隆菌株可能在科室內(nèi)部甚至科室之間存在克隆流行，應(yīng)及時(shí)有效地切斷病原菌的醫(yī)院內(nèi)感染途徑，遵守?zé)o菌技術(shù)操作規(guī)程，加強(qiáng)病房的感染管理，增強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生意識(shí)，嚴(yán)格實(shí)施隔離措施，加強(qiáng)環(huán)境清潔和消毒工作等防控措施，從而避免病原菌在醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)流行。

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Survey and research on drug resistance phenotype and molecular epidem iology of multi-drug resistant pseudomonas

aeruginosa*

Song Min，Xiang Chengyu，Ding Yinhuan，Yang Kui，Wu Zecai，Lin Yan，Liu Jinbo△（Department of Clinical Lab-oratory，Affiliated Hospital of South westMedicalUniversity，Luzhou，Sichuan 646000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.006

A

1009-5519（2016）08-1135-03

瀘州市人民政府戰(zhàn)略合作科技項(xiàng)目（2013CDLZ-S15號(hào)）；瀘州醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究資助項(xiàng)目（2013ZRQN034）。

宋敏（1985-），碩士研究生，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

△，E-mail：lizonglin85@163.com。

（2016-01-17）