黃榮祥，余嵐嵐，聶　琨，唐　劍，何文波，馬　亮（廈門麥克奧迪醫(yī)學(xué)檢驗所，福建廈門361006）

實用化改良Feulgen染色法的研究

黃榮祥，余嵐嵐，聶琨，唐劍，何文波，馬亮（廈門麥克奧迪醫(yī)學(xué)檢驗所，福建廈門361006）

目的探討一套具有重復(fù)性強、染色穩(wěn)定、耗時短、可大規(guī)模推廣的改良Feulgen染色法（TEM35），為臨床科研的應(yīng)用提供方法學(xué)指導(dǎo)。方法選取該所2014年3～4月收集的符合實驗條件的21例液基宮頸標(biāo)本，每例宮頸標(biāo)本混勻后制成2張片子，將42張片子分為兩組，每組各21張，采用TEM35、經(jīng)典Feulgen染色法（TEM25）分別對兩組涂片染色，采用Motic DNA圖像分析系統(tǒng)測量二倍體細胞核的積分光密度（IOD）及其變異系數(shù)（CV），并對測量結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果TEM25所得的整體IOD平均值為114.554，而TEM35所得平均值為112.933，IOD一致性較好（Kendall′s τ=0.692，P＜0.01）。TEM25所得CV值為8.166，而TEM35所得CV值為7.732，CV一致性略好（Kendall′s τ=0.568，P＜0.01）。結(jié)論實用化的TEM35所獲結(jié)果與TEM25所獲結(jié)果高度一致，且TEM35耗時短、染色特異性好。

染色與標(biāo)記；病理學(xué)；圖像處理，計算機輔助；DNA；腫瘤

近年來，隨著惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的不斷提高，惡性腫瘤已經(jīng)成為疾病致死的首要原因?；谌蚰[瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)（GLOBOCAN）估計，2012年全球癌癥新發(fā)病例1 410萬，死亡病例820萬［1］。國家癌癥中心分析數(shù)據(jù)估計，2015年中國癌癥總發(fā)病例數(shù)為429.16萬，總死亡病例281.42萬［2］，大約每分鐘有6人被診斷為癌癥［3］，中國因癌癥死亡的病例總數(shù)占全球的近1/4［4］。癌癥將對中國乃至全球的公共衛(wèi)生服務(wù)造成越來越大的負擔(dān)，因此腫瘤的早期診斷顯得尤為重要。惡性腫瘤的診斷和預(yù)后評價所公認的方法為細胞病理學(xué)，然而該方法受限于病理醫(yī)生的診療水平，具有隨意及主觀性強的缺點。細胞DNA圖像分析則是一種客觀、可控、獨立的病理診斷新技術(shù)，能更早地定量反映腫瘤細胞生長情況。大量研究表明，單獨采用細胞DNA圖像分析或聯(lián)合細胞學(xué)、分子診斷學(xué)、免疫學(xué)等方法對惡性腫瘤的早期診斷、治療、預(yù)后均具有重要的指導(dǎo)意義［5-9］。自從1924年Feulgen等建立了DNA-Feulgen染色方法以來，F(xiàn)eulgen染色法即成為了DNA圖像定量分析的“金標(biāo)準”［10］。然而，現(xiàn)有的經(jīng)典Feulgen染色法（TEM25）操作時間較長，難以滿足臨床快速病理診斷的要求。針對TEM25耗時長的缺點，多位該領(lǐng)域的研究人員曾試圖通過各種方法來縮短染色時間［11-15］。然而，這些快速染色法往往片面地追求速度而忽略了臨床的實用性，其所需條件苛刻難以控制，染色效果不穩(wěn)定，僅適用于科研，難以在醫(yī)院推廣應(yīng)用。醫(yī)院或醫(yī)學(xué)檢驗機構(gòu)迫切需要一種既省時又實用、可靠的Feulgen染色法。本研究通過對歐洲細胞病理學(xué)會推薦的TEM25［16-17］進行長期摸索，反復(fù)改進，利用Motic DNA圖像分析系統(tǒng)測量和分析宮頸細胞涂片上細胞核的DNA含量，并多次與TEM25的DNA測定結(jié)果對比，以期研究出一套具有重復(fù)性強、染色穩(wěn)定、耗時短、可大規(guī)模推廣的改良Feulgen染色法（TEM35）。

1　材料與方法

1.1材料隨機抽取本所2014年3～4月所收集的符合實驗條件的液基宮頸細胞標(biāo)本21例，每例宮頸標(biāo)本混勻后制成2張片子，將42張片子分為兩組，每組各21張，自然晾干備用。

1.2儀器與試劑Bohm-Sprenger固定液配置：甲醇、甲醛、冰醋酸按16∶3∶1分別量取，攪拌混勻，裝入儲存瓶中封存?zhèn)溆?，以上試劑及無水乙醇、鹽酸、二甲苯等均為分析純，由西隴化工股份有限公司提供。Motic DNA圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）、SHP-250FE智能生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1細胞DNA染色液配置量取196 mL蒸餾水于攪拌瓶中，加入乙酸硫堇酯和偏重亞硫酸鹽各0.2 g，加入4 mL 5 mol/L鹽酸，攪拌染色液混合物，過濾或真空抽濾染色液，染色液應(yīng)呈藍紫色，過濾后無可見沉淀物。

1.3.2Feulgen染色

1.3.2.1TEM25Bohm-Sprenger固定液固定50 min （25℃），流水沖洗；5 mol/L鹽酸水解60 min（25℃），流水沖洗；硫堇染色液染色75 min（25℃），流水沖洗；蒸餾水漂洗15 min（25℃），梯度乙醇脫水，過二甲苯，封片。以上均在室溫下操作。

1.3.2.2TEM35Bohm-Sprenger固定液固定 30 min （35℃），流水沖洗；5 mol/L鹽酸水解25 min（35℃），流水沖洗；硫堇染色液染色40 min（35℃），流水沖洗；蒸餾水漂洗5 min（35℃），梯度乙醇脫水，過二甲苯，封片。固定液、5mol/L鹽酸、染色液、蒸餾水均提前預(yù)熱至35℃。

1.3.3宮頸細胞核參數(shù)的測量按Motic DNA圖像分析系統(tǒng)測量光密度的操作要求，測量宮頸標(biāo)本細胞核的積分光密度（IOD），分別計算二倍體細胞核的IOD平均值及其變異系數(shù)（CV）值，以IOD平均值作為二倍體細胞核DNA含量的代表值。DNA含量測定時的差異以CV表示，CV=標(biāo)準差/平均值×100%，均為系統(tǒng)自動生成。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對2種染色方法結(jié)果的一致性進行分析。采用Kendall′s系統(tǒng)進行評價，將2種染色方法測量值分別排序并轉(zhuǎn)換成秩次，檢查兩組數(shù)值排序的一致性。計算2種方法所測IOD、CV的95%置信區(qū)間。

2　結(jié)　果

2.1鏡下效果TEM35染色穩(wěn)定、細胞核染色深，且著色鮮艷、核輪廓清晰，細胞質(zhì)及玻片背景干凈，獲得了較為滿意的效果。TEM25及TEM35染色效果分別見圖1。

圖1　宮頸脫落細胞染色效果圖（Fulgen染色，200×）

2.2宮頸標(biāo)本二倍體細胞核IOD平均值、CV值分布情況

2.2.12種染色法所得21例宮頸標(biāo)本二倍體細胞核IOD平均值、CV值線性分布情況TEM25與TEM35所測得每張宮頸片二倍體細胞核IOD平均值、CV值分布情況見圖2、3。21例標(biāo)本的2種染色方法之間有較明顯的直線回歸，IOD的回歸系數(shù)為1.137，CV的回歸系數(shù)為0.864。

圖2　21例宮頸標(biāo)本二倍體細胞核IOD平均值線性分布

圖3　21例宮頸標(biāo)本二倍體細胞核CV值線性分布

2.2.22種染色法所得21例宮頸標(biāo)本二倍體細胞核IOD、CV值一致性評價采用TEM25所得的21例宮頸標(biāo)本二倍體細胞核的 IOD平均值為 114.554，而TEM35為112.933，二者較為相近。一致性檢驗結(jié)果表明，2種染色法的IOD一致性較好（Kendall′s τ=0.692，P＜0.01）。TEM25所得CV值為8.166，而TEM35為7.732。一致性檢驗結(jié)果表明，2種染色法的CV一致性略好（Kendall′s τ=0.568，P＜0.01），見表1。

表1　2種染色法所得21例宮頸標(biāo)本二倍體細胞核IOD、CV值情況

3　討　論

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從分子水平研究細胞病理已成為熱點。在眾多技術(shù)中，細胞DNA圖像分析正被越來越廣泛地應(yīng)用。目前，F(xiàn)eulgen染色仍然是DNA圖像分析系統(tǒng)的標(biāo)準染色方法。其作用機制主要是細胞DNA經(jīng)鹽酸水解，脫氧核糖與嘌呤之間的糖苷鍵斷開，嘌呤堿基被解離，脫氧核糖（五碳糖）一端形成游離醛基，染色液中硫堇和亞硫酸根形成的中間產(chǎn)物與暴露出的游離醛基相互作用，生成藍紫色化合物，從而使細胞核中的DNA呈藍紫色。根據(jù)上述原理，F(xiàn)eulgen染色既是一種特異的染色方法，也是一種特殊的化學(xué)反應(yīng)，提高反應(yīng)溫度是加快反應(yīng)、縮短染色時間的一條重要途徑。溫度是影響鹽酸水解的關(guān)鍵因素，酸解不充分或過度酸解都將影響DNA染色效果。僅當(dāng)酸解暴露的游離醛基總量處于最大值時，才能與飽和的染色液充分結(jié)合，顯示出所有的DNA。本實驗表明，于5 mol/L鹽酸（35℃）中水解25 min即可完成DNA游離醛基的最大化。

在細胞DNA染色液中，溫度適當(dāng)提高，使醛基與染料更快、更充分地接觸，既縮短染色液反應(yīng)時間，又保證染色效果。本實驗表明，DNA在此環(huán)境中染色40 min即達反應(yīng)平衡最高點，較TEM25時間縮短近半。整個配制、染色過程均在35℃環(huán)境中進行，無須煮沸、降溫等，增強了染色液反應(yīng)的穩(wěn)定性。2種方法的染色液有效時長及使用次數(shù)基本一致，為了達到最佳染色效果，染色液不重復(fù)使用，僅限當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用。此外，該染色液與其他Schiff試劑同樣存在如下問題：配制時應(yīng)避光，攪拌、過濾、染色要盡量在同一溫度下操作，否則攪拌時已溶解的染料會由于溫度變化而析出，造成結(jié)晶，影響染色與定量。

從本實驗結(jié)果來看，TEM35縮短了著色時間，色彩清晰。與TEM25相比，2種方法所測得各標(biāo)本的二倍體細胞核IOD平均值一致性高，呈明顯的線性關(guān)系，且CV值相近，CV反映了各細胞之間的著色效果，CV越小，細胞之間的著色差異越小，DNA染色越一致，著色特異性越強。以上分析說明，TEM35能夠使細胞核DNA充分地水解，并與染色試劑更充分地結(jié)合，滿足了細胞DNA圖像分析系統(tǒng)對準確度與精確度的標(biāo)準要求。Kendall′s τ等級相關(guān)分析是反映分類變量相關(guān)性的指標(biāo)，適用于2個變量均為有序分類的情況。運用統(tǒng)計學(xué)的Kendall′s τ一致性檢驗來評價2種染色方法的一致性，既可定量又可定性，使評價更客觀，為后續(xù)研究提供一種可供參考的評價方法。

固定液可改變DNA分子結(jié)構(gòu)，影響DNA對鹽酸的敏感性，不恰當(dāng)?shù)墓潭ㄒ荷踔量赡芷茐腄NA結(jié)構(gòu)，使之無法酸解或解離成DNA小片段。Bohm-Sprenger混合固定液含甲醛、甲醇、冰醋酸，甲醛是現(xiàn)階段病理學(xué)評價較為常用的固定液，其能迅速穿透細胞，是一種相當(dāng)好的快速固定劑。此外，甲醛具有致癌性，已有實驗室開始探討使用環(huán)保型固定劑作為醛類固定劑的替代品［18］。醇能將核蛋白固定成水溶性狀態(tài)，使DNA暴露在水性液體中，有利于染料的結(jié)合。冰醋酸可以抵消組織因醛、醇導(dǎo)致的高度收縮和硬化作用，冰醋酸的滲透性很強，可快速固定細胞核內(nèi)的染色質(zhì)核蛋白，是固定染色質(zhì)的極佳選擇，有效避免因核固縮影響細胞DNA圖像分析的精準性［19］。

近幾十年來，科研工作者試圖通過多種途徑提高反應(yīng)溫度，追求快速，結(jié)果導(dǎo)致染色不穩(wěn)定、可靠性低，不利于臨床實際應(yīng)用。TEM35在解決上述問題的基礎(chǔ)上，同時避免了以下問題：作者通過大量的實踐發(fā)現(xiàn)，僅當(dāng)反應(yīng)溫度不高于35℃時，揮發(fā)性氣體能被工作人員接受，且未有切片脫落現(xiàn)象，減少了重制片、重染色情況的發(fā)生。該溫度下對細胞微觀結(jié)構(gòu)的破壞最小，符合人體生理溫度，最大限度地保證細胞原始形態(tài)功能，為聯(lián)合免疫組織化學(xué)、原位雜交等提供可能。

綜上所述，TEM35大大地縮短了染色時間，為細胞DNA圖像分析技術(shù)作為腫瘤診斷中的重要手段提供了保障。與免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交技術(shù)、細胞學(xué)的聯(lián)合輔助診斷將是未來發(fā)展的一個趨勢，如何在一張切片上體現(xiàn)多種診斷，對于TEM35既是機遇又是挑戰(zhàn)。實用化的TEM35最大限度地綜合各方面的優(yōu)勢，使其在提升染色速度的同時又能保持穩(wěn)定性、可靠性，非常適合在各大醫(yī)療機構(gòu)推廣應(yīng)用。

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Study on practical improved Feulgen staining method

Huang Rongxiang，Yu Lanlan，Nie Kun，Tang Jian，He Wenbo，Ma Liang（Xiamen Motic Medical Laboratory Institute，Xiamen，F(xiàn)ujian 361006，China）

ObjectiveTo explore a set of strongly repetitive，dyeing stable，short time-consuming and large-scale popularization improved Feulgen staining method（TEM35）to provide the methodological guidance for clinical scientific research applications.MethodsTwenty-one specimens of liquid-based cervical smear from March 2014 to May 2014 in our institute were selected.Each cervical specimen was made for 2 sections after mixing and all the sections were divided into two groups，21 sections in each group.The two groups were respectively stained by using the TEM35 and classical Feulgen staining method （TEM25）.The Motic DNA image analysis system was used to measure the diploid cell nuclear（IOD）and its coefficient of variation （CV）value，and the measurement results were analyzed statistically.ResultsThe overall IOD average value measured by TEM25 was 114.554 and which measured by TEM35 was 112.933，IOD had better consistency（Kendall′s τ=0.692，P＜0.01）.The CV value by TEM25 was 8.166，while which by TEM35 was 7.732，CV had slightly better consistency（Kendall′s τ=0.568，P＜0.01）. ConclusionThe results obtained by using the practical improved Feulgen staining method are highly consistent with those by using the classical Feulgen staining，moreover which has short time-consuming and good staining specificity.

Staining and labeling；Pathology；Image processing，computer-assisted；DNA；Neoplasms

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.15.008

A

1009-5519（2016）15-2298-03

黃榮祥（1986-），主要從事細胞病理學(xué)及細胞圖像分析方向的研究。

（2016-03-14）