馬少丹，曾躍彬，薛藝抒，袁秋兒，嚴艷花，鄺慧嫻，陳婷婷，陳藝瑛，杜寶玲△（.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州508；.廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院，廣東508）

腫瘤靶向細胞穿膜肽的設(shè)計合成及活性檢測*

馬少丹1，曾躍彬2，薛藝抒1，袁秋兒1，嚴艷花1，鄺慧嫻1，陳婷婷1，陳藝瑛1，杜寶玲1△
（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州510182；2.廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院，廣東510182）

目的合成一種可活化細胞穿膜肽（ACPPs）并初步探索其穿膜活性及亞細胞分布。方法應(yīng)用化學(xué)合成方法合成ACPPs，采用流式細胞儀檢測ACPPs穿膜活性，免疫熒光法及全波長酶標儀檢測表達ACPPs的腫瘤靶向性穿膜作用，用熒光顯微鏡觀察ACPPs在細胞內(nèi)的定位及ACPPs-pc-Ad.egfp復(fù)合物的亞細胞分布。結(jié)果成功合成了ACPPs，ACPPs-異硫氰酸熒光素（FITC）組較牛血清清蛋白-FITC組熒光量大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4 656.600，P=0.000），ACPPs具有腫瘤靶向性穿膜活性，人肺癌細胞A549、人結(jié)腸癌細胞SW480、人卵巢癌細胞OVCAR3細胞質(zhì)內(nèi)熒光量較人支氣管上皮細胞HBE大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37 947.676，P=0.000）；ACPPs定位于細胞質(zhì)并介導(dǎo)ACPPs-pc-Ad.egfp復(fù)合物分布于細胞質(zhì)。結(jié)論成功合成了ACPPs，ACPPs具有腫瘤靶向性穿膜活性并分布于細胞質(zhì)。

腫瘤/治療；亞細胞部分；大分子物質(zhì)；細胞穿膜肽；靶向

細胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是目前最強、最快的跨膜轉(zhuǎn)運分子，具有水溶性、低裂解性并通過非吞噬作用進入各種細胞膜等特點［1-5］，給腫瘤的治療帶來新的機遇。在CPPs基礎(chǔ)上改造而成的發(fā)夾狀復(fù)合CPPs稱為腫瘤靶向性CPPs，又稱為可活化CPPs （activatable cellpenetrating peptide，ACPPs）。Jiang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，ACPPs具有運載“貨物”范圍廣、可操作性強的特點，無須通過表達系統(tǒng)進行表達及純化，人工合成即可，簡便易行，不僅可作為獨立的腫瘤靶向分子給藥，還可與多種合成分子連接后共同給藥。因而已逐漸應(yīng)用于細胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運等領(lǐng)域［6－9］。本研究設(shè)計了新的ACPPs，通過檢測其腫瘤靶向性及亞細胞分布以獲得能分布于細胞質(zhì)的靶向性跨膜轉(zhuǎn)運分子，以期克服大分子藥物治療固有的細胞攝取障礙，旨在為提高大分子藥物治療的有效性提供有價值的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與腺病毒人支氣管上皮細胞HBE（簡稱HBE）、人肺癌細胞A549（簡稱A549）及SPCA1（簡稱SPCA1）、人結(jié)腸癌細胞SW480（簡稱SW480）、人卵巢癌細胞OVCAR3（簡稱OVCAR3）、人肝癌細胞HepG2（簡稱HepG2）均為廣州醫(yī)科大學(xué)病理實驗室保存。重組腺病毒載體——Ad.egfp為廣州醫(yī)科大學(xué)病理教研室保存。

1.1.2主要試劑低相對分子質(zhì)量蛋白標準購自Takara公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein fluorescein，F(xiàn)ITC）及四甲基偶氮唑藍購自威佳生物工程公司，1640培養(yǎng)基、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基及胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品，青霉素、鏈霉素及瓊脂均為Sigma公司產(chǎn)品，高分子載體——聚N-（2-羥丙基）甲基丙烯酰胺［poly N-（2-hydroxypropyl methacrylamide），pHPMA］為華西醫(yī)科大學(xué)黃園教授贈送。

1.2方法

1.2.1靶向分子ACPPs的合成及熒光素標記靶向分子ACPPs（EEEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRRN）的合成由英韋創(chuàng)津公司完成。取ACPPs 10 μmol用FITC標記，觀察生成淡黃色絮狀沉淀后4℃10 000 r/min離心10 min，棄上清液，用冰乙醚洗3次，低溫、低壓干燥，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2熒光顯微鏡觀測ACPPs穿透腫瘤細胞膜能力收集對數(shù)生長期A549、OVCAR3、SW480、HepG2并計數(shù)，用培養(yǎng)基重懸細胞，以每孔5×105個細胞數(shù)量加入到6孔培養(yǎng)板中，以20 μmol/L FITC標記ACPPs，37℃作用4 h；分別用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌、甲醇固定10 min后用含50%甘油的PBS封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.2.3流式細胞儀檢測ACPPs穿透細胞能力收集每毫升5×105個A549，以每管1 mL分裝至13個離心管中，分別加入FITC標記的ACPPs和FITC標記的牛血清清蛋白（bovine serum albumin，BSA），同時設(shè)置不加蛋白的陰性對照管，37℃孵育后分別于1、2、3、4、5、6 h取樣，4℃離心后用4%臺盼藍溶液重懸細胞團，用流式細胞儀檢測熒光強度，以熒光強度為縱坐標，以取樣時間為橫坐標作時間反應(yīng)曲線。

1.2.4細胞免疫熒光染色法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2蛋白表達將A549、HBE爬片加入到6孔培養(yǎng)板中，每種細胞分為空白組及加藥組。分別用培養(yǎng)基及終質(zhì)量濃度為10 mg/L強力霉素（多西環(huán)素，MMP抑制劑）培養(yǎng)48 h；然后用4%多聚甲醛固定，分別用兔抗人MMP-2單克隆抗體（1∶100）及熒光素標記羊抗兔免疫球蛋白G于37℃分別孵育120、60 min，加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）避光染核15min，于倒置熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.2.5熒光顯微鏡觀測ACPPs腫瘤靶向性穿膜作用將5×105個A549、SW480、OVCAR3、HepG2、HBE加入到6孔培養(yǎng)板中，每種細胞分為空白組及加藥組。分別加入培養(yǎng)基及終質(zhì)量濃度為10 mg/L強力霉素并加入終濃度為20 μmol/L FITC標記ACPPs作用4 h；洗滌、固定、封片后于倒置熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.2.6全波長酶標儀檢測ACPPs腫瘤靶向性穿膜活性取對數(shù)生長期A549、SW480、OVCAR3、HBE消化后計數(shù)，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔5 000個細胞，以A549、SW480、OVCAR3為研究組，以HBE為對照組，分別在96孔培養(yǎng)板中加入4、6、8、10、20、40、100 μmol/L ACPPs，每種藥物濃度設(shè)3個平行孔。吸棄培養(yǎng)基，每孔用PBS洗3次后用全波長酶標儀測定488 nm吸光度值。

1.2.7熒光顯微鏡觀測ACPPs在腫瘤細胞中的定位收集對數(shù)生長期A549及SPCA1，以每孔5×105個細胞數(shù)量加入到6孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)過夜，加入終濃度為20 μmol/L FITC標記ACPPs，37℃作用4 h后洗滌、固定，加入終質(zhì)量濃度為1μg/mLDAPI，室溫避光反應(yīng)30min；用PBS洗3次，加入400 μL含50%甘油的PBS封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.2.8熒光顯微鏡觀測ACPPs-藥物復(fù)合物在細胞質(zhì)的表達取終質(zhì)量濃度為10 mg/mL pHPMA溶液加入1010vp Ad.egfp后4℃反應(yīng)2 h形成pc-Ad.egfp（pc-Ad.egfp組），加入終質(zhì)量濃度為100 ng/mL ACPPs，4℃繼續(xù)反應(yīng)10h形成最終接合物（ACPPs-pc-Ad.egfp組）。反應(yīng)完成后取5 μL產(chǎn)物，與無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的A549孵育，同時加入等量Ad.egfp作為對照（Ad.egfp組），2 h后吸棄上清液，用PBS洗3次，加入含10%血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后于倒置熒光顯微鏡下以488 nm波長激發(fā)藍光，觀察并照相。

1.2.9熒光顯微鏡觀測ACPPs-藥物復(fù)合物在腫瘤細胞中的共定位取終質(zhì)量濃度為10 mg/mL pHPMA溶液加入Ad.Egfp后4℃反應(yīng)2 h，加入100 ng/mL ACPPs，4℃反應(yīng)10 h。產(chǎn)物以104vp將（FITC）ACPPs-pc-Ad.egfp［碘化丙啶（propidium iodide，PI）］感染A549 4 h，于倒置熒光顯微鏡下λex 488nm與λem538nm檢測ACPPs-FITC，λex 540、λem 625 nm檢測pc-Ad.egfp（PI），觀察并照相。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，細胞內(nèi)FITC熒光量比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1ACPPs的合成及熒光素標記ACPPs氨基酸序列為EEEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRRN，分子式為C116H200N48O41，其結(jié)構(gòu)見圖1。ACPPs與FITC在碳酸氫鈉緩沖溶液反應(yīng)完成后經(jīng)冰乙醚洗滌沉淀并干燥后得淡黃色粉末。

圖1　ACPPs結(jié)構(gòu)圖

2.2ACPPs穿透腫瘤細胞膜能力與ACPPs-FITC孵育后A549、SW480、OVCAR3、HepG2內(nèi)部均有較強綠色熒光，見圖2。

2.3ACPPs穿透細胞能力ACPPs-FITC組較BSA-FITC組熒光量大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4 656.600，P=0.000），見圖3。

2.4A549與HBE MMP-2蛋白表達比較空白組A549細胞質(zhì)內(nèi)可見綠色熒光，HBE細胞質(zhì)內(nèi)僅見微弱綠色熒光，A549 MMP-2蛋白表達較HBE強；加藥組A549、HBE細胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光均較弱，見圖4。

圖2　各腫瘤細胞孵育4 h熒光圖（200×）

圖3　ACPPs-FITC組與BSA-FITC組熒光量比較

圖4　A549與HBE MMP-2蛋白表達比較（200×）

2.5ACPPs腫瘤靶向性穿膜作用空白組A549、SW480、OVCAR3內(nèi)均有較強綠色熒光，HBE內(nèi)僅見較弱綠色熒光；加藥組A549、SW480、OVCAR3、HBE內(nèi)均未見明顯綠色熒光，見圖5。

2.6ACPPs腫瘤靶向性穿膜活性A549、SW480、OVCAR3內(nèi)熒光量較HBE大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 37 947.676，P=0.000）。4、6、8、10、20、40、100 μmol/LACPPs干預(yù)下A549、SW480、OVCAR3、HBE內(nèi)熒光量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71 140.350，P=0.000），見圖6。

圖5　空白組及加藥組A549、SW480、OVCAR3、HBE孵育4 h后熒光圖（100×）

圖6　A549、SW480、OVCAR3、HBE內(nèi)熒光量比較

2.7ACPPs在腫瘤細胞中的定位A549、SPCA1內(nèi)均有較強綠色熒光，則主要存在于細胞質(zhì)中，同時細胞核中也有較弱綠色熒光，見圖7。

圖7　A549、SPCA1孵育4 h后熒光圖（400×）

2.8ACPPs-藥物復(fù)合物細胞質(zhì)內(nèi)表達pc-Ad.egfp組僅見微量綠色熒光蛋白表達，ACPPs-pc-Ad.egfp、Ad. egfp組均可見強烈綠色熒光蛋白表達，見圖8。

圖8　ACPPs共價修飾pHPMA并感染細胞后Ad.egfp表達

2.9ACPPs-藥物復(fù)合物亞細胞分布ACPPs-FITC、pc-Ad.egfp（PI）2種熒光分布于相同區(qū)域，見圖9。

圖9　ACPPs-FITC與pc-Ad.egfp（PI）的細胞內(nèi)共定位

3　討　論

ACPPs結(jié)構(gòu)特征：（1）具有細胞膜穿透功能的活性中心CPPs區(qū)（RRRRRRRRN）；（2）具有穿膜功能抑制區(qū)（EEEEEEEEE）；（3）MMP識別區(qū)PLGLAG。由于MMP-2多表達于惡性腫瘤細胞內(nèi)，腫瘤細胞分泌的MMP可識別并切斷PLGLAG序列，使CPPs恢復(fù)活性并穿膜進入腫瘤細胞。由于腫瘤細胞高表達MMP，因而ACPPs穿膜作用具有腫瘤選擇性。本研究FITC熒光檢測結(jié)果顯示，腫瘤細胞內(nèi)FITC熒光較強，正常細胞內(nèi)FITC熒光較弱；且腫瘤細胞內(nèi)熒光強度隨時間延長明顯增加，而HBE熒光強度隨時間延長并無明顯增加。驗證了ACPPs腫瘤靶向性的特性。MMP-2/MMP-9是腫瘤特異性酶中最常見的一種，可表達于多種惡性腫瘤細胞內(nèi)，參與腫瘤的侵入與轉(zhuǎn)移［10-14］，因而，本研究合成的ACPPs可適用于多種腫瘤。

CPPs還可通過共價或非共價連接與藥物分子形成復(fù)合物，增強藥物分子的腫瘤靶向性。本研究結(jié)果顯示，ACPPs-FITC與腫瘤細胞37℃孵育4 h后就能觀察到明顯的綠色熒光，與BSA-FITC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；DAPI染色顯示，綠色熒光主要存在于細胞質(zhì)中；ACPPs-pc-Ad.egfp組可見大量綠色熒光蛋白表達，證明ACPPs-pc-Ad.egfp感染了A549并表達腺病毒綠色熒光蛋白；腺病毒的亞細胞分布顯示，ACPPs-FTTC與pc-Ad.egfp（PI）熒光在細胞質(zhì)中富集，證明ACPPspc-Ad.egfp通過ACPPs的穿膜作用進入細胞質(zhì)的現(xiàn)象。

總之，本研究設(shè)計合成了腫瘤靶向肽——ACPPs，并將其與藥物分子結(jié)合形成復(fù)合物，提高了藥物的腫瘤靶向性，加速了藥物內(nèi)化進入細胞質(zhì)，改善了藥物的跨膜運輸及亞細胞分布。

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Design and synthesis of tumor targeted cell penetrating peptides and its activity detection*

Ma Shaodan1，Zeng Yuebin2，Xue Yishu1，Yuan Qiuer1，Yan Yanhua1，Kuang Huixian1，Chen Tingting1，Chen Yiying1，Du Baoling1△（1.Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong 510182，China；2.Zengcheng District People's Hospital of Guangzhou City，Guangzhou，Guangdong 510182，China）

ObjectiveTo synthesize a activable cell-penetrating peptides（ACPPs）and to preliminarily investigate its cell-penetrating activity and subcellular distribution.MethodsACPPs was synthesized by the chemical synthesis method；the cell-penetrating activity of ACPPs was detected by the flow cytometry；the tumor-targeted cell-penetrating effect expressing ACPP was measured by the immunofluorescence and multiskan spectrum microplate spectrophotometer；the intracellular location of ACPP and the subcellular distribution of ACPPs-pc-Ad.egfp compound were examined by inverted fluorescence microscopy.ResultsACPPs was successfully synthesized，the fluorescence value in the ACPPs-FITC group was much high than that in the bovine serum albumin-FITC group，the difference was statistically significant（F=4 656.600，P=0.000）；ACPP had the tumor-targeted cell-penetrating activity，the fluorescence value in human lung cancer A549，cell human colon cancer cell SW480 and human ovarian cancer cell OVCAR3 was much high than that in human bronchial epithelial cell HBE，the difference was statistically significant（F=37 947.676，P=0.000）；ACPP was located in cytoplasm and mediated the ACPPs-pc-Ad.egfp compound to be distributed in cytoplasm.ConclusionACPPs is successfully synthesized，which exhibits the cell-penetrating activity and is distributed in cytoplasm.

Neoplasms/therapy；Subcellular fractions；Macromolecular substances；Activatable cellpenetrating peptide；Targeted

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.008

A

1009-5519（2016）06-0823-04

廣州醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究基金項目（2011C18）。

馬少丹（1994-），在讀本科學(xué)生，主要從事腫瘤生物治療研究。

△，E-mail：bl_d2002@hotmail.com。

（2015-12-25）