韓兆東，阮月芹，韓曉通，梁葵香，孫其靜，李　衛(wèi)（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：.中心實驗室；.檢驗科；.疼痛科；.產(chǎn)科，山東濱州5660）

免疫殺傷細胞治療對惡性腫瘤患者調(diào)節(jié)性T細胞的影響*

韓兆東1，阮月芹2△，韓曉通3，梁葵香4，孫其靜2，李衛(wèi)1
（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.中心實驗室；2.檢驗科；3.疼痛科；4.產(chǎn)科，山東濱州256603）

目的探討免疫殺傷細胞治療對惡性腫瘤患者CD4+CD25+CD127LOW、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞的影響。方法選擇2011年5月至2014年4月該院腫瘤內(nèi)科收治的接受免疫殺傷細胞治療的惡性腫瘤患者50例作為研究對象（腫瘤組），同時選擇該院健康體檢者30例為對照組。采用流式細胞術(shù)檢測所有受檢對象治療前后外周血CD4+CD25+CD127LOW和CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞的含量。結(jié)果腫瘤組治療前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+（11.48%±1.44%、19.69%±5.01%）明顯高于對照組（4.65%±0.75%、15.35%±4.71%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤組治療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+（5.55%±0.81%、16.15%±4.61%）明顯低于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論免疫殺傷細胞治療惡性腫瘤，能夠降低腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127LOW、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞水平，糾正機體免疫失衡狀態(tài)，提高免疫功能。

殺傷細胞；T淋巴細胞，調(diào)節(jié)性；腫瘤；抗原，CD4；抗原，CD8；抗原，CD28；流式細胞術(shù)

調(diào)節(jié)性T細胞是一類具有免疫負調(diào)控功能的T細胞亞群，該類細胞通過細胞直接接觸和分泌調(diào)節(jié)性細胞因子發(fā)揮抑制效應(yīng)，逃避自身免疫反應(yīng)［1-3］，從而使少量的惡變細胞逃避免疫監(jiān)視和免疫防御，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25+regulatory T cells，CD4+CD25+Treg）明顯增多，而且CD4+CD25+細胞水平越高，預(yù)后越差［5］。目前認為，CD4+CD25+CD127LOW是更有價值的特異性檢測Treg的分子表面標記，CD8+CD28-T細胞是近年來被證實的另一種重要的調(diào)節(jié)性T細胞，這種T細胞在腫瘤患者的外周血中也大量增多，體內(nèi)外實驗均證實，其具有較強的免疫抑制作用，可抑制機體產(chǎn)生保護性抗體。然而，完全清除具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細胞會引起各種嚴重的自身免疫反應(yīng)［6］。因此，糾正患者機體內(nèi)環(huán)境的免疫失衡，降低腫瘤患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞水平，保持機體免疫穩(wěn)態(tài)，是治療腫瘤的關(guān)鍵之一。目前，免疫殺傷細胞在臨床上被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，但少見免疫殺傷細胞治療惡性腫瘤與Treg關(guān)系的報道。本研究旨在通過免疫殺傷細胞治療腫瘤，研究患者治療前后CD4+CD25+CD127LOW和CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞的變化，為免疫殺傷細胞治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2011年5月至2014年4月本院腫瘤內(nèi)科收治的不適合手術(shù)的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)中晚期惡性腫瘤患者50例作為研究對象。其中男28例，女22例；年齡16～76歲，平均（46.0±0.5）歲；肺癌7例，結(jié)直腸癌8例，肝癌4例，乳腺癌10例，腎癌4例，惡性黑色素瘤3例，鼻咽癌2例，膀胱癌4例，胃癌8例。WHO生存質(zhì)量評分0～3分，未進行化療和放療治療。白細胞計數(shù)均在4.0×109L-1以上，肝腎功能、心電圖、凝血功能無異常；無自身免疫性疾病及糖尿病，無癲癇病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者均簽署知情同意書。另選擇同期在本院體檢的健康人30例作為對照組，其中男16例，女14例；年齡20～70歲，平均（45.0±0.4）歲。

1.2儀器與試劑FC-500大型流式細胞儀、Q-PREP溶血制備儀均為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)。小鼠抗人單克隆抗體CD4-藻紅蛋白（CD4-PE）、CD25-異硫氰酸熒光素（CD25-FITC）、CD127-PC5、CD8-FITC、CD28-PC5及同型對照 IgG2a-FITC、IgG2a-PC5均購于美國CALTAG Laboratories公司；免疫殺傷細胞試劑購于德國慕尼黑大學(xué)免疫治療中心；全血溶血試劑購自美國Coulter公司。

1.3方法

1.3.1患者單個核細胞采集用血細胞分離機采用單個核細胞采集程序。循環(huán)血量為1 000～1 500 mL，需要30～40 min（按照40 mL/min計算），得到外周血單個核細胞體積為30～40 mL，細胞數(shù)約10×108個。

1.3.2淋巴細胞純化 將白細胞分離產(chǎn)物（30～40 mL）用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至200 mL。將25 mL淋巴細胞懸液小心置于 13 mL淋巴細胞分層液上，840 r/min離心23 min，小心吸出淋巴細胞層并置于50mL離心管中，加RPMI1640培養(yǎng)基至總體積50 mL，750 r/min離心12 min。棄去上清液，用45 mL RPMI1640重懸淋巴細胞，并平均分裝于2支50 mL離心管中，取樣計數(shù)，離心去上清液，用48 mL無血清培養(yǎng)基將細胞重懸。其中一管用于免疫殺傷細胞第一步激活，另一管用于免疫殺傷細胞二次激活。

1.3.3免疫殺傷細胞制備將純化得到的單個核細胞進行鏈式激活和誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到免疫殺傷細胞（約2.0× 109個），其主要效應(yīng)細胞為CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷T細胞（NKT細胞）、自然殺傷細胞（NK細胞）和樹突狀細胞（DC細胞）。

1.3.4免疫殺傷細胞的收獲及凍存將細胞培養(yǎng)產(chǎn)物750 r/min離心8 min去上清液，并用生理鹽水重懸計數(shù)，同時取樣送質(zhì)量控制組檢測。細胞750r/min離心8 min，去上清液并用20 mL冷凍液A（含10%人血清清蛋白磷酸鹽緩沖液），置于冰上，緩慢加入20 mL預(yù)冷的冷凍液B（含20%二甲基亞砜磷酸鹽緩沖液）充分混勻，分裝于20支冷凍管（體積1.8 mL）中。細胞保存于-80℃低溫冰箱中待用。

1.3.5質(zhì)量控制取細胞凍存前的離心上清液進行微生物檢測，均未檢出普通厭氧、需氧菌，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋體，人類免疫缺陷病毒，內(nèi)毒素及真菌。取細胞凍存前的細胞懸液進行細胞表型檢測，細胞表型符合下列要求：CD4+T細胞 50.0%±5.1%、CD8+T細胞35.0%±3.2%、NKT細胞30.0%±2.1%、NK細胞7.0%±1.0%、DC細胞1.0%±0.2%。

1.3.6免疫殺傷細胞的復(fù)蘇將需復(fù)蘇的細胞冷凍管于37℃恒溫水浴中化凍，并移入預(yù)置10 mL細胞復(fù)蘇液（95 mL無菌生理鹽水中加入5 mL人血清清蛋白后，用0.1 μm一次性濾器過濾）的離心管中，離心，并用10 mL生理鹽水重懸，離心，重復(fù)以上步驟3次。取樣，進行臺盼藍染色并計數(shù)。用2 mL細胞復(fù)蘇液重懸，并轉(zhuǎn)移到100 mL生理鹽水中（含1%人血清清蛋白），準備回輸。

1.3.7免疫殺傷細胞回輸每個療程20次，每天1次，連續(xù)20 d。

1.3.8標本采集及處理患者于治療開始前和治療結(jié)束后第3天分別靜脈常規(guī)采血2 mL置于含EDTA-K2防凝管中，室溫保存，在12 h內(nèi)檢測分析。

1.3.9流式細胞儀分析（1）用Flow-check進行光路和流路校準，使所有熒光信號變異系數(shù)（CV）＜2%。（2）在標有同型對照試管1中分別加入CD4-PE試劑及IgG2a-FITC、IgG2a-PC5同型對照各20 μL，在標有同型對照試管2中分別加入CD8-FITC試劑和IgG2a-PC5同型對照各20 μL，各管分別再加入健康人EDTA-K2防凝血100 μL（5×105個細胞）混勻，室溫避光15 min后，在標本制備儀上溶血、固定上機。以CD4-PE及側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門A于CD4+細胞群或以CD8-FITC及SSC設(shè)門A于CD8+細胞群。分析A門細胞，調(diào)節(jié)電壓使CD25 和CD127及CD28細胞群位于陰性區(qū)，并進行顏色補償。（3）在標有測試管1中加入單克隆抗體CD4-PE、CD25-FITC、CD127-PC5各20 μL，在標有測試管2中加入單克隆抗體CD8-FITC、CD28-PC5各20μL；分別加入各實驗組或?qū)φ战MEDTA-K2防凝血100 μL（5×105個細胞）混勻，室溫避光15 min后，在標本制備儀上溶血、固定上機，檢測每個樣本CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/ CD8+的含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1流式細胞儀檢測腫瘤患者免疫細胞治療前后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+細胞分析見圖1、2。

圖1　調(diào)節(jié)性T細胞CD4+CD25+CD127LOW分析圖

圖2　調(diào)節(jié)性T細胞CD8+CD28-分析圖

2.2檢測結(jié)果腫瘤組治療前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤組治療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+含量明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；腫瘤組治療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+含量略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　兩組外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+含量比較（±s，%）

表1　兩組外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+含量比較（±s，%）

注：-表示無此項；與對照組和治療后比較，aP＜0.05。

組別n CD4+CD25+CD127LOW/CD4+　CD8+CD28-/CD8+對照組腫瘤組治療前治療后30 50 4.65±0.75 15.35±4.71 19.69±5.01a16.15±4.61 --11.48±1.44a5.55±0.81

3　討　論

腫瘤免疫治療中自體細胞免疫治療在國內(nèi)經(jīng)歷了長時間的應(yīng)用，并已證明該方法的有效性，顯示出其在未來腫瘤治療中的前景。研究顯示，自體細胞免疫治療惡性腫瘤能提高患者外周血CD4+、CD8+數(shù)量及CD4+/ CD8+比值，改善機體的免疫功能［7-9］。但自體細胞免疫治療惡性腫瘤與患者調(diào)節(jié)性T細胞的關(guān)系研究鮮見報道。本研究中，應(yīng)用鏈式激活和誘導(dǎo)的免疫殺傷細胞治療50例中晚期惡性腫瘤患者，結(jié)果顯示腫瘤組治療前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與文獻［10-12］報道一致。腫瘤組治療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD8+CD28-/CD8+明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明鏈式激活和誘導(dǎo)的免疫殺傷細胞能降低患者CD4+CD25+CD127LOW、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞，并接近健康人水平，改善機體免疫失衡狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組免疫殺傷細胞治療后，患者CD4+CD25+CD127LOW、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞水平明顯降低與免疫殺傷細胞的效應(yīng)細胞主要為激活和誘導(dǎo)的CD4+T細胞占50.0%±5.1%、CD8+T細胞占35.0%±3.2%有密切關(guān)系，CD4+T細胞能分泌大量的細胞因子調(diào)節(jié)細胞失衡和輔助抑制性T細胞殺傷腫瘤細胞［13］，調(diào)節(jié)免疫失衡狀態(tài)。

綜上所述，鏈式激活和誘導(dǎo)的免疫殺傷細胞治療惡性腫瘤，能降低患者CD4+CD25+CD127LOW、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞水平，并使之接近健康人的水平，使失衡的免疫狀態(tài)得到糾正，為患者進一步綜合治療奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of immune killer cells therapy on regulatory T cells in patients with malignant tumor*

Han Zhaodong1，Ruan Yue-qin2△，Han Xiaotong3，Liang Kuixiang4，Sun Qijing2，Li Wei1（1.Central Laboratory；2.Department of Clinical laboratory；3.Department of Pain；4.Department of Obstetrics，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou，Shandong 256603，China）

ObjectiveTo investigate the effect of immune killer cells therapy on CD4+CD25+CD127LOWand CD8+CD28-regulatory T cells in the patients with malignant tumor.MethodsFifty patients with malignant tumor treated by the immune killer cells therapy in the oncology department of our hospital from May 2011 to April 2014 were taken as the research subjects （tumor group）and 30 individuals undergoing the healthy physical examination were selected as the control group.Flow cytometry was used to detect the peripheral blood CD4+CD25+CD127LOWand T regulatory CD4+cells with CD8+CD28-and CD8+.Results

The peripheral blood CD4+CD25+CD127LOW/CD4+and CD8+CD28-/CD8+before treatment in the tumor group were 11.48%±1.44% and 19.69%±5.01%，which were significantly higher than 4.65%±0.75%and 15.35%±4.71%in the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The peripheral blood CD4+CD25+CD127LOW/CD4+and CD8+CD28-/CD8+after treatment in the tumor group were 5.55%±0.81%and 16.15%±4.61%，which were significantly lower than before treatment with statistical differences；but slightly higher than those in the control group without statistical differences（P＞0.05）.ConclusionImmune killer cells in treating malignant tumor can reduce the peripheral blood CD4+CD25+CD127LOW，CD8+CD28-regulatory T cells level，corrects the immune imbalance state and improves the immune function.

Killer cells；T-lymphocytes，regulatory；Neoplasms；Antigens，CD4；Antigens，CD8；Antigens，CD28；Flow cytometry

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.004

A

1009-5519（2016）07-0972-03

濱州醫(yī)學(xué)院科技計劃項目（BY2012KJ13）。

韓兆東（1963-），副主任技師，主要從事細胞免疫學(xué)及分子生物學(xué)研究。

△，E-mail：13563089341@163.com。

（2015-12-30）