王 松 容艷芬 陳智國* 鄒志濤

（湖北省食品藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評(píng)核查中心·武漢 430071）

草蓯蓉提取物特征圖譜研究*

王 松 容艷芬**陳智國***鄒志濤****

（湖北省食品藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評(píng)核查中心·武漢 430071）

目的:建立草蓯蓉提取物的特征圖譜。方法：采用高效液相色譜法以Agilent C18(4.6×250mm,5μm)色譜柱，乙腈-水梯度洗脫，流速：0～60min 0.5mL·min-1，60～110min 0.8mL·min-1，檢測波長260nm，柱溫30℃。結(jié)果:10批草蓯蓉提取物特征圖譜相似度較高, 利用“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”生成了草蓯蓉提取物的對(duì)照特征圖譜,共有19個(gè)特征峰。結(jié)論:采用HPLC特征圖譜技術(shù)可以有效地對(duì)草蓯蓉提取物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

草蓯蓉提取物 特征圖譜 高效液相色譜法

草蓯蓉(Boschniakia rossica Fedtsch et Flerov)系列當(dāng)科草蓯蓉屬(Boschniakia)植物，俗名不老草[1-2]。主要分布于中國長白山地區(qū)、日本富士山及朝鮮北部山區(qū)等。草蓯蓉具有補(bǔ)腎壯陽、潤腸止血、滋補(bǔ)強(qiáng)身及延年益壽的功效，用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、習(xí)慣性便秘、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎等疾病[3-4]。草蓯蓉為東北傳統(tǒng)道地藥材，其化學(xué)成分復(fù)雜，經(jīng)醇提后的草蓯蓉提取物具有保肝、抗脂質(zhì)過氧化的活性等藥理作用[5]。目前，關(guān)于草蓯蓉提取物有效成分尚不明確,對(duì)于草蓯蓉提取物的質(zhì)量控制研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬利用HPLC法對(duì)草蓯蓉醇提物進(jìn)行分析，建立草蓯蓉提取物的特征圖譜，從整體成分控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與材料

DIONEX高效液相色譜儀(DIONEX UV3000液相色譜系統(tǒng))；草蓯蓉(產(chǎn)地:長白山)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張秀橋教授鑒定為列當(dāng)科植物草蓯蓉(Boschniakia rossicaFedtsch et Flerov)的干燥全草;草蓯蓉提取物:取草蓯蓉干燥后的全草，粉碎成粗粉，用90%乙醇做溶劑，提取3次，每次1h，合并濾液，減壓濃縮，干燥，研成細(xì)粉，加適量輔料，混合均勻，即得。乙腈(TEDIA)為色譜純、水為超純水，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備。精密稱取草蓯蓉提取物5g，加50%乙醇100ml,稱定重量，浸泡過夜。再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量。過濾，濾液揮干，加水10ml溶解，用氯仿萃取水液(3次，每次10ml),合并氯仿層，揮干，加甲醇10ml，定容。用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 檢查方法。高效液相色譜法[6-10]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(4.6×250mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫。柱溫30℃；檢測波長：260nm；進(jìn)樣10μl，洗脫梯度變化條件：0～60min（10:90），流速：0.5mL·min-1，60～110min（30:70），流速：0.8mL?min-1。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各共有色譜峰保留時(shí)間和峰面積，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在1.3%～1.9%之間，相對(duì)峰面積的RSD值在1.54%～2.29%之間，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》中關(guān)于藥材部分的要求，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12h進(jìn)樣，記錄特征圖譜。結(jié)果表明，19個(gè)主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間無明顯變化，RSD小于2.0%，各共有峰面積比值RSD小于3.0%，結(jié)果說明檢測方法與供試品穩(wěn)定。符合特征圖譜研究的技術(shù)要求。

2.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批供試品5份，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)行檢測，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD在1.24%～1.72%之間，相對(duì)峰面積的RSD在1.62%～2.25%之間，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，說明本方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.3 特征圖譜的建立

2.3.1 共有特征峰的標(biāo)定 分別檢測10批草蓯蓉提取物的HPLC特征圖譜，10批草蓯蓉提取物的特征圖譜數(shù)據(jù)見表1、2。在上述色譜條件下，供試品在80min內(nèi)大約出峰24個(gè)，其中19個(gè)色譜峰是各批供試品所共有。共有峰總面積占總峰面積的93%，各個(gè)供試品特征峰的峰形及相對(duì)保留時(shí)間較為一致，10批草蓯蓉提取物的色譜中，共有特征峰重疊率為90%以上。據(jù)此確定為草蓯蓉提取物的主要特征峰。

2.3.2 草蓯蓉提取物的對(duì)照特征圖譜 根據(jù)各供試品的色譜參數(shù)，將各供試品均含有的特征成分14號(hào)峰作為參照峰(S峰)，確定各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值等技術(shù)參數(shù)。19個(gè)共有特征峰(相對(duì)保留時(shí)間)和共有特征峰面積比值,見表1和表2。據(jù)此確定為草蓯蓉提取物的對(duì)照特征圖譜。

表1 10批草蓯蓉提取物共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間(n=10）

表1 10批草蓯蓉提取物共有特征峰的相對(duì)峰面積

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2.3.3 相似度評(píng)價(jià) 分別以對(duì)照特征圖譜為參照,利用“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A 版”軟件采用夾角余弦法計(jì)算10批草蓯蓉提取物供試品的相似度，相似度在0.93～0.98。結(jié)果表明對(duì)草蓯蓉提取物具有質(zhì)量控制意義。

3 討論

（1）參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》，采用高效液相色譜法建立了草蓯蓉提取物的特征指紋圖譜，共標(biāo)定了19個(gè)共有指紋峰，方法可靠、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好。

（2）圖譜中3號(hào)峰峰面積最大，但其出峰頻次為9次，且峰型較差，理論塔板數(shù)沒有14號(hào)峰高。3號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD%值都較高，其精密度沒有14號(hào)峰高，最后我們選擇峰面積其次的14號(hào)峰作為S峰。

（3）試驗(yàn)過程中比較了238、254、260、275、283、290nm等處檢測波長，結(jié)果表明，檢測波長為260nm波長時(shí)色譜峰較多且峰形較好，綜合考慮，選定260nm為特征圖譜檢測波長。

[1] 馬毓泉.內(nèi)蒙植物志(第5卷)[M].呼和浩特:內(nèi)蒙古人民出版社,1980.

[2] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志 (第69卷) [M].北京:科學(xué)出版社, 1999.

[3] 李彩峰,王曉琴,劉勇,肖培根.草蓯蓉化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中草藥,2014, 45 (7):1016-1023.

[4] 國家中醫(yī)藥管理局.中華本草(第20卷)) [M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999.

[5] 馬茜茜,元海丹,葉利,樸光春.不同草蓯蓉提取物中化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43（7）:11-14.

[6] 謝潔娜,趙明波,吳鳳薇,屠鵬飛.荒漠肉蓯蓉的HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥,2005,36(2): 268-271.

[7] 楊建華,堵年生,熱娜?卡斯木,胡君萍.HPLC測定肉蓯蓉中8-表馬錢子苷酸的含量[J].藥物分析雜志,2006,26(10):1395-1397.

[8] 盧永昌,林鵬程,林生秀.高效液相色譜法測定肉蓯蓉中麥角甾苷的含量[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào),2006,32 (4):709-711.

[9] 龔立冬,曹玉華,侯建霞.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定肉蓯蓉中的甜菜堿[J].色譜,2007,25(2):280-281.

[10] 張英,鞠愛華,周秀娟,張慧文.草蓯蓉藥材高效液相指紋圖譜研究[J].中國藥業(yè),2013,22(16):30-32.

（2017-03-13 收稿）

* 國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)基金（201007012）。

** 通訊作者

*** 湖北中醫(yī)藥大學(xué)·武漢 430065

**** 三峽大學(xué)中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中醫(yī)醫(yī)院·湖北 443003