成松，劉成永，張雪迪，侯遠(yuǎn)沛，周冬青，閆家微，魏素梅，秦艷秋

（1、徐州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 徐州221004；2、徐州市傳染病醫(yī)院院感科，江蘇 徐州221004）

液基夾層杯技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液中抗酸桿菌對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值

成松1，劉成永1，張雪迪1，侯遠(yuǎn)沛1，周冬青1，閆家微1，魏素梅1，秦艷秋2△

（1、徐州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 徐州221004；2、徐州市傳染病醫(yī)院院感科，江蘇 徐州221004）

目的 評(píng)估利用液基夾層杯離心涂片集菌技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液中抗酸桿菌對(duì)菌陰肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值。方法 選取我院收治的106例菌陰肺結(jié)核患者，所有患者均進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液液基夾層杯離心涂片集菌法，熒光定量PCR（FQ-PCR）法，羅氏培養(yǎng)進(jìn)行抗酸桿菌檢測。并通過與羅氏培養(yǎng)法的比較分析液基夾層杯離心涂片集菌法的靈敏度、特異度及臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果 羅氏培養(yǎng)法和液基夾層杯離心涂片集菌法對(duì)臨床確診的菌陰肺結(jié)核患者支氣管肺泡灌洗液抗酸桿菌檢出率分別為66.0%，70.7%，兩者的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.231，P=0.267，P＞0.05）。結(jié)論 液基夾層杯離心涂片集菌法檢測支氣管肺泡灌洗液抗酸桿菌，具有快速、敏感度和特異度較高的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)肺結(jié)核具有較高的診斷價(jià)值，為痰涂片陰性及無痰患者提供良好的診斷依據(jù)。

支氣管肺泡灌洗液；液基夾層杯檢測法；抗酸桿菌；肺結(jié)核

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的全球流行的主要傳染病［1］，病原學(xué)檢查是結(jié)核病的診斷和制定化療方案的重要依據(jù)［2］。我國結(jié)核病患者患病率為459/10萬，而其中，菌陽患者119/10萬，涂陽患者是66/10萬［3］。由于檢測方法、患者因素、痰液質(zhì)量以及檢測者的業(yè)務(wù)能力等問題，存在大量的痰菌陰性肺結(jié)核病患者［4］。痰菌陰性肺結(jié)核是指影像學(xué)資料或者胸片提示有結(jié)核的特征，但一次痰結(jié)核菌培養(yǎng)為陰性，三次痰涂片也為陰性的結(jié)核患者。在我國菌陰結(jié)核患者占肺結(jié)核患者總數(shù)的70%左右［5］，如何提高這類患者的病原學(xué)檢出率，并有效而快速地作出早期的診斷，已經(jīng)成為臨床工作者比較關(guān)注的重點(diǎn)之一［6，7］。支氣管肺泡灌洗液（以下簡稱BALF）是利用纖維支氣管鏡，對(duì)肺段和亞肺段進(jìn)行灌洗后，采集的肺泡表面襯液。BALF對(duì)于一些不容易留取或者是不會(huì)咳痰的患者來說是一種有效提高病原體檢出率的方法，而且BALF更接近于病灶也能提高其檢出率［8］。因此，我們對(duì)液基夾層杯法檢測技術(shù)測定肺泡灌洗液中抗酸桿菌在肺結(jié)核的診斷價(jià)值進(jìn)行了臨床觀察?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料和方法

1.1資料來源選擇2015年1月至2015年12月收住我院結(jié)核科確診的菌陰肺結(jié)核患者118例，其中106例成功行支氣管肺泡灌洗液檢查，作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組來自徐州市中心醫(yī)院呼吸科，其中肺炎、支氣管擴(kuò)張、大葉性肺炎、間質(zhì)性肺炎和肺癌患者22例，其中男13例，女9例，男女比例1.44：1，平均年齡48.9±17.4。實(shí)驗(yàn)組中男64例，女42例，男女比例1.52：1，平均年齡44.7±16.7。年齡與性別基線水平具有可比性（P＞0.05）。本研究通過徐州市傳染病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （批件號(hào)：2015 年XC審第16號(hào)）并取得患者的知情同意。

1.2材料上述患者的BALF標(biāo)本采集方法如下：根據(jù)患者的胸片或者是CT資料，選擇支氣管飛段病變部位作為灌洗的位置；然后將生理鹽水10～25ml通過纖支鏡灌入支氣管肺段的相應(yīng)部位，然后通過負(fù)壓 （壓力為 25～100mmHg；1mmHg= 0.133kPa）吸引BALF至瓶中，此操作可以重復(fù)灌洗2-3次，收集BALF15～20ml左右，送檢驗(yàn)科檢測。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器和試劑液基夾層杯離心涂片集菌試劑由湖南天騎公司提供，包括振蕩器，恒溫干片機(jī)，離心涂片機(jī)，高速離心機(jī)等。羅氏培養(yǎng)基購于貝索公司；PCR擴(kuò)增儀器采用西安天隆TL-988型FQ-PCR儀，試劑盒試劑購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用PEMS 3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以羅氏培養(yǎng)法結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算液基夾層杯法的敏感度、特異度、和約登指數(shù)。液基夾層杯法和羅氏培養(yǎng)法等的陽性檢出率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組BALF檢測情況中液基夾層杯離心集菌法分別與羅氏培養(yǎng)法和熒光定量PCR法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=1.231，P=0.267，P＞0.05；χ2=1.714，P=0.189，P＞0.05。詳見表1。

2.2以羅氏培養(yǎng)法作為標(biāo)準(zhǔn)，那么液基夾層杯離心集菌法的靈敏度、特異度、和約登指數(shù)分別為94.3%，87.1%，0.814。詳見表2，表3。

3　討論

據(jù)報(bào)道，肺結(jié)核患者中，2/3以上為菌陰型［9］，臨床上根據(jù)患者的臨床癥狀和胸片以及影像學(xué)資料來診斷結(jié)核，容易造成患者的漏診和誤診，對(duì)于結(jié)核病的控制不利。并且痰涂片抗酸桿菌陰性的病人并不意味著痰液中無結(jié)核桿菌，這與患者留取痰液標(biāo)本的質(zhì)量，排菌量的多少，病情嚴(yán)重的程度，方法的局限性以及實(shí)驗(yàn)人員的檢測水平等有關(guān)，其影響因素較多，從而導(dǎo)致了一部分排菌患者被錯(cuò)誤地診斷為菌陰［10］。據(jù)報(bào)道，接觸菌陰性肺結(jié)核患者被感染的幾率大概為7.3%～21.0%［11］。痰培養(yǎng)是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但是結(jié)核菌的培養(yǎng)所需要的時(shí)間較長，一般在4～8周左右；所以，如何快速高效地發(fā)現(xiàn)傳染源，提高對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢出率，對(duì)患者的疾病預(yù)防和治療都有重要的價(jià)值。

表1　三種檢測方法對(duì)BALF中結(jié)核分枝桿菌的檢出結(jié)果

表2　液基夾層杯離心集菌法與羅氏培養(yǎng)法結(jié)果對(duì)比

表3　液基夾層杯離心集菌法與熒光定量PCR法結(jié)果對(duì)比

近年來，纖維支氣管鏡檢查技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為臨床提供了一種更高效的檢測手段，對(duì)結(jié)核病患者的診斷具有重要的臨床價(jià)值，因?yàn)槔w維支氣管鏡檢查直接取材于病變部位，其中的菌量濃度高，獲得結(jié)核分枝桿菌的機(jī)會(huì)增多，而且經(jīng)纖維支氣管鏡檢查獲得的支氣管肺泡灌洗液污染率低，對(duì)于一些無痰患者也可以檢測。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，以羅氏培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)液基夾層杯離心集菌法對(duì)痰液抗酸桿菌檢測的靈敏度高于直接涂片法［13］。這也在一定程度上說明了液基夾層杯離心集菌法提高了對(duì)結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)率，對(duì)結(jié)核病治療和預(yù)防有著重要的臨床意義。

液基夾層杯離心集菌法是對(duì)直接涂片法進(jìn)行改良和創(chuàng)新的基礎(chǔ)上形成的，該技術(shù)主要原理為經(jīng)過消化滅活液消化后的標(biāo)本通過濾過式夾層杯過濾，將抗酸桿菌阻攔在納米硅介質(zhì)微孔濾膜膜片上，直接染色。取出膜片置于滴有光媒介液體的閱片夾中可以直接通過普通顯微鏡進(jìn)行觀察。液基夾層杯離心集菌法不僅具有檢出的陽性率高，生物安全性高，操作的標(biāo)準(zhǔn)化程度高，以及可以批量處理標(biāo)本等優(yōu)點(diǎn)；而且還保留了直接涂片直觀，快速的特點(diǎn)；此技術(shù)的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)表現(xiàn)在標(biāo)本的消化處理和高速離心集菌以及批量處理標(biāo)本這幾個(gè)方面，其作用主要表現(xiàn)在以下三個(gè)方面：一是批量處理標(biāo)本；二是此種方法提供的消化液能徹底消化標(biāo)本中的黏蛋白，能很好的釋放菌體；三是滅活結(jié)核分枝桿菌，保障后期操作步驟的生物安全，后面的操作步驟就是通過高溫加熱，然后高速離心，將釋放出的已經(jīng)滅活的菌體集聚到彭氏夾層杯底部的基片上，然后再通過染色，鏡檢；其步驟與直接涂片法大體一致。基于以上創(chuàng)新點(diǎn)，液基夾層杯離心集菌法具有生物安全性高和檢出陽性率高的特點(diǎn)［14］，因此本研究采用液基夾層杯離心集菌技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液中的抗酸桿菌。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)BALF中抗酸桿菌用液基夾層杯離心集菌法、羅氏培養(yǎng)法、以及熒光定量PCR法檢測的比較，三種方法的陽性率分別為70.7%，66.0%，77.4%。液基夾層杯離心集菌法的陽性率高于羅氏培養(yǎng)法，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且雖低于熒光定量PCR法但也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此液基夾層杯離心集菌法與羅氏培養(yǎng)法和熒光定量PCR法有良好的一致性。以羅氏培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，液基夾層杯離心集菌法的特異度，靈敏度、和約登指數(shù)分別為87.1%，94.3%，0.814，因此有較好的檢測能力和準(zhǔn)確性。羅氏培養(yǎng)法與液基夾層杯離心集菌法和熒光定量PCR法不相符標(biāo)本的情況分析：液基夾層杯離心集菌法陽性而羅氏培養(yǎng)法陰性9例中，經(jīng)熒光定量PCR法檢測陽性7例，可能原因是死菌。液基夾層杯離心集菌法陰性而熒光定量PCR法陽性7例，經(jīng)羅氏培養(yǎng)3例陽性4例陰性。液基夾層杯離心集菌法也存在缺點(diǎn)，就是其不能正確的區(qū)分是活菌還是死菌；這也在一定程度上造成了與羅氏培養(yǎng)法不相符合的結(jié)果，這也有待于臨床醫(yī)生通過其他的檢測方法來分析判斷［15］。

綜上所述，在結(jié)核病防治的嚴(yán)峻形勢下，早期診斷已成為控制結(jié)核病傳染的關(guān)鍵因素［16］，而液基夾層杯技術(shù)提高了肺結(jié)核病人的標(biāo)本陽性檢出率，且操作簡單，安全性高［17］，所以液基夾層杯技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液中的抗酸桿菌在實(shí)驗(yàn)室用于結(jié)核病的診斷具有很大的推廣價(jià)值。

［1］Vishnevskiiu BI，Manicheva OA，Vishnevskaia EB，et al.The specific features ofbacterial isolation 21and dmg resistance of My cobacteria in extraptd monary tuberculosis［J］.Probl Tuberk Bolezn legh，2006，11：18-21.

［2］Kubista M，Andrade JM，Bengtsson M，et al.The real-time polymerasw chain reaction［J］.Mol Aspects Med，2006，27（2-3）：95-125.

［3］全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告 ［J］.中國防癆雜志，2012，34（5）：485-508.

［4］李燕，劉成永，侯遠(yuǎn)沛，等.提高痰標(biāo)本采集合格率加強(qiáng)抗生素應(yīng)用的監(jiān)測［J］.護(hù)理實(shí)踐與研究，2012，9（21）：122-123.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì).肺結(jié)核診斷和治療指南［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（1）：70-74.

［6］肖和平.菌陰肺結(jié)核在結(jié)核病控制中的重要性［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28：665-666.

［7］歐喜超，趙雁林.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷及存在的難題［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（1）：97-99.

［8］張繼萍，柳曉金，葉迎賓，等.支氣管鏡肺泡灌洗液改良抗酸染色法診斷菌陰性肺結(jié)核的價(jià)值探討 ［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（13）：1702-1703.

［9］全圍結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣謝查報(bào)告［J］.中國防癆雜志，2002，24（2）：65-108.

［10］李峰，可春梅，付津平，等.支氣管肺泡灌洗液檢測對(duì)診斷痰涂片陰性肺結(jié)核的效果評(píng)價(jià)［J］.中國防癆雜志，2012，34（4）：261-263.

［11］顧紅艷，戴建忠，施軍衛(wèi)，等.支氣管肺泡灌洗液多指標(biāo)聯(lián)合檢測對(duì)不典型肺結(jié)核的診斷價(jià)值探討［J］.臨床肺科雜志，2008，13 （9）：1149-1150.

［12］吳國蘭，陳曉紅，李學(xué)玲，等.4種不同支氣管肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌檢測方法在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究［J］.中國臨床醫(yī)生，2013，41（3）：39-41.

［13］楊華林，譚云洪，白麗瓊，等.液基夾層杯技術(shù)檢測抗酸桿菌應(yīng)用性研究［J］.中國防癆雜志，2011，32（5）：279-282.

［14］宋紅煥，季明，唐國鋒，等.液基夾層杯技術(shù)用于基層實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病診斷的可行性研究［J］.中國防癆雜志，2012，34（7）：441-444.

［15］王淑俠，劉成永，閆家微，等.夾層杯離心涂片集菌法快速檢測抗酸桿菌臨床應(yīng)用的初步觀察 ［J］.中國防癆雜志，2009，31（9）：535-537.

［16］胡彥，陳娟娟，王小中.結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室診斷方法及評(píng)價(jià)［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，34（2）：177-179.

［17］熊國亮.液基夾層集菌技術(shù)檢測痰標(biāo)本中抗酸桿菌對(duì)診斷肺結(jié)核的應(yīng)用價(jià)值［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，31（5）：412-413.

Detection of acid-fast bacillus with liquid-based interlayer vessel technique in brocho-alveolar lavage fluid to assess the diagnostic value of sputum bacterium negative pulmonary tuberculosis

CHENG Song，LIU Chengyong，ZHANG Xuedi，HOU Yuanpei，ZHOU Dongqing，YAN Jiawei，WEI sumei，QIN yanqiu.1.Department of Clinical laboratory，Xuzhou infectious diseases hospital，Xuzhou，Jiangsu；2.The infection-control Department of XuZhou infectious disease hospital，xuzhou，Jiangsu，221004，china.

Objective To assess the diagnostic value of sputum bacterium negative pulmonary tuberculosis with detection of acid-fast bacillus in brocho-alveolar lavage fluid（BALF）by liquid-based interlayer vessel technique.Methods Selecting 106 cases of hospitalized patients with sputum bacterium negative tuberculosis，the methods of liquid-based interlayer vessel technique，fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）and L-J culture were used to detect mycobacterium tuberculosis in BALF derived from all patients.the sensitivity，specificity and clinical application value of liquid-based interlayer vessel technique were evaluated by comparing with the L-J culture method.Results The detection rate of acid-fast bacillus with L-J culture method and liquid-based interlayer vessel technique was 66.0%，70.7%respectively in BALF derived from patients with sputum bacterium negative pulmonary tuberculosis，there was no significant difference in the positive rate detected by the two methods（chi-square=1.231，P=1.231，P＞0.05）.Conclusion liquid-based interlayer vessel technique has the advantages of faster，more sensitive and specific，and it has high value in the diagnosis of pulmonary tuberculosis and provide a good basis for the diagnosis of patients with sputum smear negative and patients without sputum.

Brocho-alveolar lavage fluid；Liquid-based interlayer vessel technique；Acid-fast bacillus；Pulmonary tuberculosis

R378.91，R521

A

1674-1129（2016）04-0428-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.006

成松，男，1982年11月出生，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事結(jié)核病的細(xì)菌，免疫，分子生物學(xué)工作。

秦艷秋，女，1972年12月生，本科，副主任護(hù)師，主要從事生物安全防護(hù)及醫(yī)院感染工作。E-mail:95235544@qq.com，

（2016-04-01；

2016-06-20）