孔小祥，仲崇明

（連云港市中醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港222004）

實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA測量不確定度的評定

孔小祥，仲崇明

（連云港市中醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港222004）

目的 探討實驗室實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA測量不確定度的評定方法，并對其臨床應用進行分析評價。方法 依據(jù)CNAS-TRL-001：2012《醫(yī)學實驗室——測量不確定度的評定與表達》，以室內(nèi)質(zhì)量控制評定實驗室測量復現(xiàn)性，以有證參考物質(zhì)（CRM）評定偏倚，以測量復現(xiàn)性和偏倚評定測量不確定度。結(jié)果 高、中、低值擴展不確定度（k=2）分別為0.99、1.14、0.94（對數(shù)值），相對擴展不確定度（k=2）分別為9.15%、24.7%、31.1%。結(jié)論 以復現(xiàn)性和偏倚評定HBV-DNA測量不確定度方法有效可行，適合實驗室測量不確定度的評定，適合實驗室之間測量不確定度的比較分析。

測量不確定度；乙型肝炎病毒DNA；實時熒光定量PCR

乙型肝炎病毒（HBV）復制再活化起始于HBV復制的增強，HBV-DNA定量檢測，可評估HBV復制的水平［1，2］，對于判斷乙型肝炎病毒在體內(nèi)的復制情況、判斷治療時機以及藥物治療效果監(jiān)測等都有著重要意義。隨著實時熒光定量PCR應用于HBV-DNA定量檢測，二級以上醫(yī)院廣泛開展。實驗室方法學性能驗證或評價、實驗室結(jié)果分散性的評定，都是實驗室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。測量不確定度是檢測結(jié)果分散性的最好表示，同時也是溯源性的表示，ISO15189 2012也闡述了不確定度的作用與要求。本文參照CNAS-TRL-001：2012《醫(yī)學實驗室——測量不確定度的評定與表達》，按“從上到下”的評定方法，利用室內(nèi)期間不精密度、偏椅（引用標準物質(zhì)）等數(shù)據(jù)，對實時熒光PCR定量檢測HBV-DNA測量不確定度作評定。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑TL-988熒光定量基因擴增儀（西安天隆科技有限公司）；GL-16G-Ⅱ高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；GL-15金屬恒溫器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。試劑及HBVDNA定量校準品 （上海復星長征醫(yī)學科學有限公司產(chǎn)品，批號：20150315）。

1.2標準物質(zhì)北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，國制標物證書分別為：GBW（E）090137、GBW（E）090138、GBW （E）090139，成品批號：201502001、201504002、201502001，靶值（對數(shù)值及參考范圍）分別為：1.40×103IU/ml（3.15，2.65～3.65）、5.90×104IU/ ml（4.77，4.27～5.27）、4.60×106IU/ml（6.66，6.16～7.16）。室內(nèi)質(zhì)控品為實驗室自制品，制備方法為：收集兩對半全陰、無溶血、無黃疸血清，56℃30min，離心去除沉淀雜物，計量血清總量適當加入定值標準物質(zhì)，重復測量，計算平均值、標準差。

1.3方法

1.3.1HBV-DNA抽提、擴增取100μl核酸提取液A以及100μl待測樣本加入離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，放入離心機12000r/min離心10min，吸去上清液，加入50μl核酸提取液B（提取液B中加入內(nèi)參），振蕩混勻，100℃金屬浴 10min，取出后12000r/min離心2min，取7μl提取純化好的乙肝DNA，加入43μl反應液擴增管中，上機擴增。擴增程序：50℃，2min，1個循環(huán)；94℃，5min，1個循環(huán)；94℃ 10s，60℃ 45s，60℃采集FAM、JOE熒光通道的信號，共40個循環(huán)。

1.3.2測量不確定度分量（來源）實驗室測量復現(xiàn)性（隨機誤差）；偏倚（系統(tǒng)誤差）。

1.3.3實驗室測量復現(xiàn)性自制高值、中值、低值質(zhì)控血清，隨樣本批次檢測，計算3個月時間內(nèi)平均值、標準差及CV（%）值。

1.3.4偏倚引入測量不確定度的評定采用分析有證參考物質(zhì)/標準物質(zhì)（CRM）的方法評定偏倚引入的測量不確定度。標準物質(zhì) GBW（E）090137 （201502001）、GBW （E）090138（201504002）、GBW （E）090139（201502001）分別5次重復檢測。

標準物質(zhì)的測量不確定度為uCref=0.25；相對不確定度。偏倚合成不確定度：偏倚引入合成不確定度來源于偏倚、標準物質(zhì)重復測量及標準物質(zhì)本身不確定度，計算公式為；

1.3.5合成不確定度合成不確定度即實驗室不精密度和實驗室偏倚合成，公式為：

1.3.6擴展不確定度包含因子（k）取2，即包含概率為0.95或95%。公式為：U=2×uc；Urel=2×ucrel。

2　結(jié)果

2.1不精密度自制高值、中值、低值質(zhì)控品平均值（對數(shù)值）、標準差及CV（%）值分別為6.12，0.10，1.58%；4.30，0.14，3.27%；3.26，0.15，4.70%（表1）。

表1　室內(nèi)質(zhì)控不精密度

2.2偏倚引入測量不確定度的評定（標準物質(zhì)不確定度分量）有證參考物質(zhì)/標準物質(zhì)（CRM）在本實驗室檢測結(jié)果顯示高、中、低值偏倚均為負值，即檢測結(jié)果均偏低于標準示值，但其絕對值均＜0.50，符合中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準——核酸擴增檢測用試劑（盒）（YY/T 1182-2010）要求。高、中、低值相對偏倚分別為1.95%、9.85%、11.4%。高、中、低值偏倚合成不確定度分別為0.48、0.55和0.45，相差不大；高、中、低值偏倚相對合成不確定度分別為4.29%、11.9%、14.8%（表2）。

表2　偏倚引入測量不確定度的評定

2.3合成不確定度高值樣本（含量對數(shù)值6.12）、中值樣本（含量對數(shù)值4.30）、低值樣本（含量對數(shù)值3.26）合成標準不確定度（對數(shù)值）分別為0.49、0.57、0.47，相對合成標準不確定度分別為4.58%、12.4%、15.6%。

2.4擴展不確定度高值樣本（含量對數(shù)值6.12）、中值樣本（含量對數(shù)值4.30）、低值樣本（含量對數(shù)值3.26）擴展不確定度 （k=2）（對數(shù)值）分別為0.99、1.14、0.94，相對擴展不確定度（k=2）分別為9.15%、24.7%、31.1%。

3　討論

HBV-DNA定量檢測是判斷慢性HBV感染者是否需要盡早治療、評估哪些患者需要抗病毒治療以及治療療效監(jiān)測最直接最可靠的指標［3-5］。所以HBV-DNA定量檢測的準確性在臨床應用中非常重要。隨著臨床對HBV-DNA定量檢測的重視，隨著實時熒光定時PCR技術(shù)的發(fā)展，二級以上醫(yī)院已廣泛開展實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA。但不同的實驗室條件差異、實驗室檢測系統(tǒng)的差異以及量值溯源性的不同，致使HBV-DNA檢測在不同實驗室或同一實驗室不同時期或不同操作人員均有不一致的結(jié)果，以致于造成臨床應用中的麻煩和困惑。這就要求實驗人員需要對使用的檢測系統(tǒng)、使用的方法進行性能驗證或評價［6-8］，對檢測誤差進行評估，即對測量不確定度進行評估。

實驗室血液學、免疫學、臨床生化等檢測指標方法學評價及不確定度的評估已有較多文獻報道［9-11］，而實時熒光定PCR檢測HBV-DNA測量不確定度的文稿報道國內(nèi)并不是很多，本文參照中國合格評定國家認可委員會2012《醫(yī)學實驗室——測量不確定度評定與表達》對本實驗室HBV-DNA測量不確定度作評估分析，無論對本實驗室質(zhì)量管理還是對目標不確定度的評定分析都將有著很好的實用價值。

本文以實驗室測量復現(xiàn)性（隨機誤差）和偏倚（系統(tǒng)誤差）作為不確定度來源。分析前的因素通常是復雜的，常無法進行精確估計，其分量應包含患者的準備、生物學變異、治療的影響、標本的采集、標本的運送等。在許多情況下，通過適當?shù)拇胧?，將它們控制到一定范圍。而分析后不確定度對于檢驗結(jié)果量值的影響可以忽略［12-14］。因此，醫(yī)學實驗室中不確定度評價的重點應該是分析中的不確定度，也即測量過程的不確定度評定。

測量復現(xiàn)性是測量不確定度的重要分量來源之一，但復現(xiàn)性評估方法不一［15］。本文以IQC數(shù)據(jù)計算期間不精密度。IQC數(shù)據(jù)量或時間段的先用多有不同，有的選用1個月、3個月、6個月，也有認為選擇1年較合適。本文選用3個月數(shù)據(jù)，本實驗室認為測量不確定度的評估不能頻繁也不能時期過長。CNAS-TRL-001：2012建議自上而下方法采用測量復現(xiàn)性與偏倚評估測量不確定度。本文參照CNAS-TRL-001：2012采用參考物質(zhì)/標準物質(zhì)（CRM）評估偏倚。包含偏倚量值引入不確定度、重復測量引入不確定度及CRM本身不確定度。本實驗室高、中、低值測量復現(xiàn)性良好，分別為1.58%、3.25%、4.70%，均符合YY/T 1182-2010要求?？紤]標準物質(zhì)的購買成本，本文標準物質(zhì)的測量分別重復5次。測量不確定度的評估應該相對于樣本含量值，本文以3個濃度含量值樣本分別評估其測量不確定度及相對測量不確定度。從本文結(jié)果看來，HBV-DNA測量不確定度的評定，對實驗室性能評估具有很好的實用價值，對實驗室之間的性能比較也具有很好的實用價值，增加了臨床應用的可信度。

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The evaluation of uncertainty in measurement of HBV-DNA by real-time fluorescence quantitative PCR

KONG Xiaoxiang，ZHONG Chongming.Clinical Laboratory，Lianyungang Chinese Medicine Hospital，Lianyungang Jiangsu 222004，China.

Objective To investigate the uncertainty in measurement of HBV-DNA by real-time fluorescence quantitative PCR and evaluate its clinical application.Methods Referring to CNAS-TRL-001：2012medical laboratory-Evaluation and expression of uncertainty in measurement，the data of internal quality control was used to assess measurement reproducibility and CRM was used to assess measurement bias.The two variables of reproducibility and bias were combined to calculate the uncertainty in measurement.Results Expanded uncertainty of high value，medium value and low value（k=2）was 0.99，1.14 and 0.94（logarithmic value）respectively.Relative expanded uncertainty of high value，medium value and low value（k=2）was 9.15%，24.7% and 31.1%respectively.Conclusion Evaluation of uncertainty in measurement of HBV-DNA using reproducibility and bias is effective and feasible，and is suitable for evaluation of laboratory uncertainty in measurement，and it is appropriate for comparison and analysis of uncertainty in measurement among different laboratories.

Uncertainty in measurement；HBV-DNA；Real-time fluorescence quantification PCR

R512.6+2

A

1674-1129（2016）04-0425-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.005

孔小祥，男，1981年10月出生，碩士，檢驗醫(yī)師，主管檢驗師，主要從事免疫學檢驗工作。

（2016-03-29；

2016-06-16）