■ 程逍妹 胡明 陳昌福

（1 武漢興物源生物科技有限公司，武漢 430040；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070）

昆蟲蛋白提取物對(duì)泥鰍免疫增強(qiáng)效果的初步研究

■ 程逍妹1胡明2陳昌福2

（1 武漢興物源生物科技有限公司，武漢 430040；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070）

為了證明昆蟲蛋白提取物對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物是否具有免疫增強(qiáng)效果，本研究對(duì)泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）采用在飼料中定量添加昆蟲蛋白提取物的方法，研究了對(duì)泥鰍的免疫增強(qiáng)效果。旨在通過系統(tǒng)地研究昆蟲蛋白提取物對(duì)養(yǎng)殖泥鰍的免疫增強(qiáng)作用，獲得昆蟲蛋白提取物在泥鰍飼料中的適宜的添加量及應(yīng)用程序等參數(shù)，為該產(chǎn)品科學(xué)應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

表1 對(duì)照和試驗(yàn)?zāi)圉q的增重量1）

表2 對(duì)照和試驗(yàn)?zāi)圉q的餌料系數(shù)1）

表3 對(duì)照和試驗(yàn)組泥鰍血清中溶菌酶活性和白細(xì)胞吞活性

表4 對(duì)照與試驗(yàn)組泥鰍血清總蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性1）

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及泥鰍的飼養(yǎng)條件

本試驗(yàn)在江蘇省射陽縣黃沙港鎮(zhèn)鹽城裕達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司進(jìn)行。將供試泥鰍放置于室內(nèi)圓形玻璃鋼水族箱中進(jìn)行飼養(yǎng)。用于本試驗(yàn)的泥鰍全部來自裕達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司的養(yǎng)殖池塘。在設(shè)置于室內(nèi)的每個(gè)盛水500.0L的水族箱中，飼養(yǎng)平均體長(zhǎng)10.4cm的400尾以上的泥鰍。試驗(yàn)期間水溫變化在（25±4）℃，光照為人工光照和自然光照。每天上午9∶00和下午18∶00各投1次鹽城裕達(dá)飼料有限公司生產(chǎn)的泥鰍專用飼料，供試泥鰍被預(yù)備試驗(yàn)飼養(yǎng)7d，待供試泥鰍完全適應(yīng)室內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境后，選擇身體無外傷、健康活潑的泥鰍進(jìn)行如下飼養(yǎng)效果的試驗(yàn)。

1.2 供試?yán)ハx蛋白提取物

用于本研究的昆蟲蛋白提取物，由武漢興物源生物科技有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表5 活菌攻毒后泥鰍的死亡率和免疫保護(hù)率

選擇沒有外傷而游動(dòng)正常的泥鰍，隨機(jī)分別投放于水族箱中，每個(gè)水族箱內(nèi)放養(yǎng)400尾泥鰍。每組免疫增強(qiáng)劑采用6個(gè)水族箱，每個(gè)劑量設(shè)定2個(gè)重復(fù)，在共18個(gè)水族箱內(nèi)完成3組泥鰍的飼養(yǎng)試驗(yàn)。在泥鰍的飼料中添加昆蟲蛋白提取物的劑量設(shè)定為0 kg/t（昆蟲對(duì)照組，“t”表示噸，下同）、50 kg/t（昆蟲I組）和100kg/t（昆蟲Ⅱ組）。

飼料中昆蟲蛋白提取物的添加方法是，將鹽城裕達(dá)飼料有限公司生產(chǎn)的泥鰍專用飼料與一定比例的昆蟲蛋白提取物均勻混合后，置于陰涼通風(fēng)處晾干。

按照預(yù)備飼料飼養(yǎng)時(shí)的飼料投喂程序，投餌量以使供試泥鰍達(dá)到飽足并有少量剩余為準(zhǔn)。對(duì)照組所用飼料中除沒有添加昆蟲蛋白提取物等物質(zhì)之外，飼料中其它營(yíng)養(yǎng)成分均沒有改變。試驗(yàn)程序是連續(xù)投喂40d。由于泥鰍外觀上難以區(qū)分雌雄。因此，在本研究中不區(qū)分試驗(yàn)動(dòng)物的性別。

1.4 吞噬原的制備

將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接種在液體肉湯培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48h后，離心集菌，在菌液中加入濃度為0.5%的福爾馬林，37℃下滅活24h，用滅菌生理鹽水清洗3次，并將其濃度調(diào)整至1.0×108cells/mL，即為福爾馬林滅活的S.aureus菌體（formalin killed S.aureus，F(xiàn)-SA），用作檢測(cè)白細(xì)胞吞噬活性的吞噬菌體。

1.5 采血

于投喂添加昆蟲蛋白提取物飼料結(jié)束后的第2d，從各試驗(yàn)個(gè)對(duì)照組中分別隨機(jī)撈取30尾泥鰍（每個(gè)平行試驗(yàn)水簇箱中各撈取15尾，以下采用相同的平均獲取樣品的方法），從泥鰍的尾主動(dòng)脈采血。將每5尾泥鰍的血液混合為一個(gè)樣品后，將血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備成抗凝血，供檢測(cè)白細(xì)胞吞噬活性；將另一份血液首先在室溫下靜置1h待其凝固，再置于4℃的冰箱保持4h后，于4℃條件下以4,000 r/min離心10min，收集上層血清，保存在4℃冰箱中，備用。

對(duì)采血后的泥鰍進(jìn)行解剖，觀察試驗(yàn)與對(duì)照組泥鰍臟器形態(tài)與顏色等方面的異同。判斷不多試驗(yàn)組與對(duì)照組是否對(duì)魚體臟器產(chǎn)生影響。

1.6 溶菌酶活性的測(cè)定

用0.067mol/L的磷酸緩沖液 （PBS,pH6.4）將溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2mg/mL 的菌懸液。每個(gè)樣品取3.0 mL菌懸液，吸取血清40.0μL加入到菌懸液中，混勻后，立刻在540nm下測(cè)定A。值。然后在28℃水浴中溫育30min，取出后置于4℃冰浴中終止反應(yīng)，再測(cè)定A值。按公式計(jì)算溶菌酶的活性：U=（A。- A）/ A。

1.7 白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定

在0.2mL抗凝血中加入0.1mL F-SA，搖勻，在28℃的恒溫水浴鍋中孵育45min，每隔10min搖動(dòng)1次。用吸管吸取血細(xì)胞涂片，每個(gè)樣品涂5張，用甲醇固定10min，Giemsa染色液染1h，水洗風(fēng)干后，鏡檢，并依下式計(jì)算白細(xì)胞吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指數(shù)（phagocytic index，PI）。

1.8 血清中補(bǔ)體C3、C4含量的測(cè)定

根據(jù)待測(cè)樣品（含校準(zhǔn)液）將反應(yīng)劑與抗體液按每1.0mL反應(yīng)劑加入50.0μL抗體液的比例配制，配好的工作液當(dāng)日用完。于干凈離心管中按照試劑與樣品比例為200∶1量加入5.0μL蒸餾水和1,000.0μL試劑，作為空白管，同時(shí)按照同樣比例加入5.0μL的校準(zhǔn)液或樣品，混勻，37℃水浴10 min，用透射比濁法在752型紫外分光光度計(jì)340 nm波長(zhǎng)處讀取測(cè)定管和標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值（A），空白管進(jìn)行儀器調(diào)零，標(biāo)準(zhǔn)管繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算補(bǔ)體 C3 和 C4 的含量。

1.9 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定

采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（上海科欣生物技術(shù)研究所產(chǎn)品）測(cè)定。

1.10 血清中總蛋白含量的測(cè)定

采用血清總蛋白試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所產(chǎn)品）測(cè)定。

1.11 攻毒試驗(yàn)

對(duì)于供試和對(duì)照泥鰍的攻毒方式采取注射的方式進(jìn)行，取人工培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌，制備成107cfu/mL的菌液濃度后，對(duì)每尾供試泥鰍的腹腔注射0.2mL后，各實(shí)驗(yàn)組均注射300尾，3個(gè)對(duì)照組各注射100尾，合計(jì)300尾。放回水族箱繼續(xù)飼養(yǎng)觀察患病與死亡狀況。

將供試泥鰍放回水族箱中繼續(xù)飼養(yǎng)時(shí)，采取充氣維持水體中有足夠的氧氣。每天投喂2次未添加任何免疫增強(qiáng)劑的顆粒飼料，并記錄魚體活動(dòng)狀態(tài)和死亡情況。最后按照如下公式計(jì)算試驗(yàn)魚的相對(duì)免疫保護(hù)率（RPS）。相對(duì)免疫保護(hù)率=[1－（免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）]×100%

1.12 解剖觀察及臟器測(cè)量

通過對(duì)每組采血后的各20尾泥鰍進(jìn)行解剖，肉眼觀察試驗(yàn)與對(duì)照組泥鰍臟器的異同，并對(duì)分離的器官和組織分別稱重，用以比較試驗(yàn)與對(duì)照組泥鰍的機(jī)體指標(biāo)異同。

1.13 誘食效果的判定

在預(yù)定連續(xù)投喂的40d中，每天統(tǒng)計(jì)供試泥鰍的攝食量，將對(duì)照組泥鰍的餌料系數(shù)作為1。評(píng)價(jià)昆蟲蛋白提取物在飼料中的不同添加量對(duì)泥鰍攝食量的影響，判斷昆蟲蛋白提取物是否具有誘導(dǎo)泥鰍攝食的效果。

1.14 促生長(zhǎng)效果的判定

在預(yù)定連續(xù)投喂40d結(jié)束后，將尚沒有用于采樣和攻毒的全部的泥鰍撈起來稱重，根據(jù)統(tǒng)計(jì)泥鰍的攝食量，計(jì)算餌料系數(shù)，將對(duì)照水族箱中飼養(yǎng)的泥鰍的餌料系數(shù)作為1。評(píng)價(jià)昆蟲蛋白提取物在飼料中的不同添加量促進(jìn)泥鰍的攝食效果，判斷昆蟲蛋白提取物是否具有促進(jìn)攝食的效果。

2 結(jié)果

2.1 昆蟲蛋白提取物等對(duì)泥鰍生長(zhǎng)速度的影響

試驗(yàn)期間對(duì)照和各試驗(yàn)組泥鰍的增重量測(cè)定結(jié)果如表1所示。首先，投喂昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組泥鰍的增重量均顯著地高于對(duì)照組的增重量（t測(cè)驗(yàn)，P＜0.05），而昆蟲蛋白提取物的不同添加劑量組之間增重量并沒有出現(xiàn)顯著的差異（t測(cè)驗(yàn)，P＞0.05）。

2.2 昆蟲蛋白提取物等對(duì)泥鰍的誘食與促生長(zhǎng)效果

根據(jù)在試驗(yàn)期間（只計(jì)算40d內(nèi)的投喂時(shí)間）對(duì)各對(duì)照和試驗(yàn)組泥鰍的增重量，以及40d的總投喂飼料數(shù)量，計(jì)算出來的餌料系數(shù)結(jié)果如表2所示。首先，投喂昆蟲蛋白提取物試驗(yàn)組泥鰍的餌料系數(shù)均顯著地低于對(duì)照組的餌料系數(shù)（t測(cè)驗(yàn)，P＜0.05），而昆蟲蛋白提取物的不同添加劑量組之間雖然餌料系數(shù)有一點(diǎn)差異，但是并沒有出現(xiàn)顯著的差異（t測(cè)驗(yàn)，P＞0.05）。

將對(duì)照組餌料系數(shù)作為1進(jìn)行比較，所有試驗(yàn)組的餌料系數(shù)均低于1，說明昆蟲蛋白提取物等對(duì)泥鰍的誘食和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用是比較明顯的。

2.3 溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性的變化

投喂添加昆蟲蛋白提取物的飼料后，對(duì)照和試驗(yàn)組泥鰍的血清溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果如表3所示。如表3所示，投喂昆蟲蛋白提取物試驗(yàn)組泥鰍血清中的溶菌酶活性顯著高于未添加任何物質(zhì)的對(duì)照組（t測(cè)驗(yàn)，P＜0.05）。白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果表明，投喂昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組血液中白細(xì)胞的PP和PI均極顯著地高于對(duì)照組（t測(cè)驗(yàn)，P＜0.01），而投喂昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組之間，泥鰍血液中白細(xì)胞的吞噬活性未出現(xiàn)顯著性差異（t測(cè)驗(yàn)，P＞0.05）。

2.4 泥鰍血清中補(bǔ)體C3、C4、總蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

供試泥鰍的血清中補(bǔ)體C3、C4、總蛋白含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定結(jié)果如表4 所示。

從表4所示結(jié)果可以看出，投喂昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組泥鰍血清中補(bǔ)體C3、C4的活性均顯著高于未添加任何物質(zhì)的對(duì)照組（t測(cè)驗(yàn)，P＜0.05）。但是，試驗(yàn)組魚體的血清中總蛋白含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性含量有所提高，而對(duì)照與試驗(yàn)組泥鰍血清中總蛋白含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性并未出現(xiàn)顯著性差別（t測(cè)驗(yàn)，P＞0.05）。值得注意的是，對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，在飼料中添加昆蟲蛋白提取物等可以降低魚體血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，但是，試驗(yàn)與對(duì)照組泥鰍之間未出現(xiàn)顯著性差異（t測(cè)驗(yàn)，P＞0.05）。

此外，對(duì)于采血后泥鰍解剖觀察的結(jié)果證明，試驗(yàn)組與對(duì)照組泥鰍的臟器均未出現(xiàn)明顯的區(qū)別。

2.5 攻毒后的存活率

采用注射嗜水氣單胞菌的方法，對(duì)試驗(yàn)和對(duì)照泥鰍經(jīng)活菌攻毒后，各組的死亡情況如表5所示。從表5可以看出，投喂蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組泥鰍對(duì)接種的嗜水氣單胞菌具有一定的免疫保護(hù)力（RPS），而在飼料中添加昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組泥鰍死亡率明顯的低于對(duì)照組。但是，各個(gè)添加昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組泥鰍之間的RPS，則未出現(xiàn)明顯的不同，而是具有大致相同的RPS。

3 討論

在本研究中，添加昆蟲蛋白提取物的試驗(yàn)組泥鰍的生長(zhǎng)狀況顯著的優(yōu)于對(duì)照組，但是不同添加量的試驗(yàn)組之間卻沒有出現(xiàn)顯著差別，這種結(jié)果表明在飼料中添加昆蟲蛋白提取物有一定的促進(jìn)泥鰍生長(zhǎng)的作用，而且當(dāng)其添加量在500～100kg/t之間，其飼養(yǎng)效果沒有出現(xiàn)顯著性差異。

對(duì)泥鰍投喂昆蟲蛋白提取物后，供試泥鰍的白細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)、血清中溶菌酶活性和補(bǔ)體C3、C4成分活性上升和經(jīng)活菌攻毒后的死亡率下降，說明投喂昆蟲蛋白提取物能提高泥鰍的非特異性和特異性免疫應(yīng)答水平。即昆蟲蛋白提取物對(duì)于泥鰍的免疫系統(tǒng)具有一定的激活作用。

通過計(jì)算試驗(yàn)組與對(duì)照組的餌料系數(shù)，認(rèn)為昆蟲蛋白提取物對(duì)泥鰍具有一定的誘食和促進(jìn)生長(zhǎng)的效果。但是，根據(jù)江蘇省鹽城裕達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司2015年在池塘中養(yǎng)殖的泥鰍計(jì)算的餌料系數(shù)僅為1.53左右，說明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)泥鰍，無論試驗(yàn)魚對(duì)照組，餌料系數(shù)均是偏高的。其原因尚值得分析。(參考文獻(xiàn)略)