■ 陳營(yíng)李云冰張文文譚鮮英（ 廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司 煙臺(tái)大學(xué)）

PirAB毒力正在向親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的非副溶血弧菌中轉(zhuǎn)移

■ 陳營(yíng)12李云冰1張文文1譚鮮英1（1 廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司 2 煙臺(tái)大學(xué)）

副溶血弧菌是一種嗜鹽性海洋細(xì)菌，廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚(yú)、蝦、貝類(lèi)動(dòng)物中。在夏秋季，副溶血弧菌是全球沿海地區(qū)致人腹瀉的主要病原菌，在我國(guó)此菌也長(zhǎng)期居于食物中毒已檢出致病菌的前列。近些年，在對(duì)蝦養(yǎng)殖中出現(xiàn)了一株特殊的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp），由于攜帶1個(gè)約69kb的大質(zhì)粒，使其完全不同于從臨床上和環(huán)境中分離的菌株。該菌株在質(zhì)粒上有兩個(gè)與昆蟲(chóng)致病相關(guān)的毒素基因pirA和pirB，它們分別表達(dá)1個(gè)13 kDa和50kDa的外毒素蛋白PirA和PirB，我們稱(chēng)這個(gè)菌株為PirAB型副溶血弧菌（PirAB-Vp）。由于pirAB毒素基因在質(zhì)粒上，通過(guò)質(zhì)粒在細(xì)菌種內(nèi)和種間的轉(zhuǎn)移，細(xì)菌可以獲得相應(yīng)的毒力。Kondo等首次報(bào)道了PirAB毒力通過(guò)質(zhì)粒向非副溶血弧菌中轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。他們?cè)谠侥媳辈康貐^(qū)的病蝦中分離出1株弧菌KC13.17.5，通過(guò)對(duì)此菌株的基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它屬于哈維氏弧菌（V.harveyi）。隨后，Liu等在V.owensii中也檢測(cè)出pirAB毒素基因，這是1個(gè)與哈維氏弧菌親緣關(guān)系很近的1個(gè)弧菌新種。在此之后，我們也檢測(cè)出攜帶pirAB毒素基因的哈維氏弧菌，并在今年的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了更多該毒力基因向其它弧菌、甚至腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。

本文分析了PirAB毒力向非副溶血弧菌轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象以及PirAB非副溶血弧菌之間的親緣關(guān)系，希望為對(duì)蝦疾病的防控提供一定的理論指導(dǎo)。

表1 基于16S rDNA的PirAB非副溶血弧菌的親緣關(guān)系分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病蝦和水樣的采集

在養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦發(fā)病時(shí)，采集病蝦的肝胰腺和水樣，接種TCBS平板。然后，送利洋公司研究所進(jìn)行PirAB-Vp檢測(cè)。

1.1.2 病蝦和水體PirAB-Vp檢測(cè)

挑取TCBS平板上的單菌落或轉(zhuǎn)接的過(guò)夜培養(yǎng)物，煮沸法制備細(xì)菌基因組模板，采用PCR方法進(jìn)行副溶血弧菌和pirA毒素基因的檢測(cè)，選取部分?jǐn)y帶pirA毒素基因的非副溶血弧菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

1.1.3 PirAB非副溶血弧菌的16S rDNA鑒定

采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R，進(jìn)行PirAB非副溶血弧菌16SrDNA序列的PCR擴(kuò)增。經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行部分測(cè)序后，在美國(guó)國(guó)家生物工程信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，確定分離菌株的最可能種屬。

1.1.4 分離菌株的親緣關(guān)系分析

采用歐洲生物信息學(xué)網(wǎng)站（EMBL）上的Clustal Omega軟件，以網(wǎng)上已知的哈維氏弧菌的16S rDNA序列（基因庫(kù)編號(hào)：NR_102976）為參照標(biāo)準(zhǔn)， 逐一對(duì)測(cè)定的16S rDNA部分序列與之進(jìn)行比對(duì)分析，確定兩者之間的親緣關(guān)系大小。

2 結(jié)果

2.1 非副溶血弧菌pirA毒素基因的檢測(cè)及菌株的親緣關(guān)系分析

2015年10～11月共檢測(cè)出22株P(guān)irAB非副溶血弧菌；2016年4月檢測(cè)出23株，5月檢測(cè)出21株。對(duì)部分菌株進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序鑒定并進(jìn)行親緣關(guān)系分析，見(jiàn)表1。

表2 部分PirAB非副溶血弧菌的來(lái)源與親緣關(guān)系分析

在鑒定的菌株中，主要為哈維氏弧菌及與其親緣關(guān)系較近的弧菌，如V.owensii、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、V.shilonii，相似率由100%降至86.89%。也有親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的霍亂弧菌（V.cholerae）、腸桿菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella），相似率為92.32%～94.78%，。

2.2 PirAB毒力已經(jīng)向親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的非副溶血弧菌中轉(zhuǎn)移

2015年10～11月鑒定的PirAB非副溶血弧菌均為哈維氏弧菌。而在今年4月開(kāi)始出現(xiàn)V.owensii和創(chuàng)傷弧菌。到5月時(shí)，檢測(cè)出的PirAB非副溶血弧菌種類(lèi)更多，親緣關(guān)系也更遠(yuǎn)，相似率最低至92.32%。更重要的是，從檢測(cè)的樣本看，從肝胰腺檢測(cè)的菌株親緣關(guān)系相對(duì)較近，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株均是在水中檢出的。而且，除了1株克雷伯氏菌外，其余均來(lái)自廣西欽州地區(qū)的養(yǎng)殖水樣，詳見(jiàn)表2。

2.3 各地區(qū)PirAB非副溶血弧菌的檢出情況

2016年4～5月是PirAB-Vp檢出的高發(fā)期，pirA陽(yáng)性菌株檢出率平均高達(dá)43.4%。其中，PirAB非副溶血弧菌為7.5%（另文發(fā)表）。在送檢的廣東、廣西、福建、海南、江蘇地區(qū)樣本中，均檢出PirAB非副溶血弧菌。其中，以福建、廣西、廣東、海南地區(qū)檢測(cè)率較高，江蘇的檢出率最低。廣西只在水中檢出，為最高值25%；福建只在肝胰腺檢出，為最高值26.9%。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4月和5月各地區(qū)PirAB非副溶血弧菌的檢出情況

3 討論

迄今為止，在國(guó)內(nèi)外僅見(jiàn)兩例關(guān)于PirAB毒力通過(guò)質(zhì)粒向非副溶血弧菌中轉(zhuǎn)移的報(bào)道，所轉(zhuǎn)移的非副溶血弧菌為哈維氏弧菌和V.owensii，并無(wú)向其它更多弧菌轉(zhuǎn)移的報(bào)道。我們?cè)?015年10～11月和2016年4～5月共檢測(cè)出66株P(guān)irAB非副溶血弧菌，獲得了很多關(guān)于PirAB毒力轉(zhuǎn)移的資料。

2016年4～5月是pirA陽(yáng)性菌株檢出的高峰期，造成了攜帶pirAB毒素基因的質(zhì)粒向副溶血弧菌和其他弧菌的廣泛轉(zhuǎn)移，使得PirAB非副溶血弧菌的檢出率高達(dá)7.5%。去年的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PirAB毒力轉(zhuǎn)移僅局限于哈維氏弧菌。而到今年的4、5月份，PirAB毒力轉(zhuǎn)移的菌種更多、親緣關(guān)系更遠(yuǎn)、危害更嚴(yán)重。

PirAB非副溶血弧菌在福建、廣西、廣東、海南地區(qū)檢測(cè)率較高，局地有高于25%的檢出率，表明毒素基因傳播較活躍。只在廣西地區(qū)的水樣和福建地區(qū)的蝦樣中檢出PirAB非副溶血弧菌，可能與這兩個(gè)地區(qū)分別采取的弧菌防控措施有關(guān)。江蘇地區(qū)的PirAB非副溶血弧菌檢出率很低，說(shuō)明毒素基因傳播的環(huán)境相對(duì)比較局限或者養(yǎng)殖水體交換少。

從PirAB非副溶血弧菌的親緣關(guān)系上看，所有親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株均來(lái)自養(yǎng)殖水體，說(shuō)明毒素質(zhì)粒在水中傳播的更廣泛、更頻繁。在一個(gè)地域內(nèi)，水源可能是毒素質(zhì)粒傳播和擴(kuò)散的主要途徑。由于外界不利環(huán)境的脅迫，會(huì)加速毒素質(zhì)粒在細(xì)菌群體間的轉(zhuǎn)移。霍亂弧菌、腸桿菌、克雷伯氏菌是常見(jiàn)的、人的腸道致病菌，這些潛在致病菌在水中出現(xiàn)，說(shuō)明水體受污染的可能性很大，而這種污染加劇了毒素質(zhì)粒的傳播。因此，搞清毒力基因的流行與傳播規(guī)律，控制質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，是防止PirAB毒力在弧菌中廣泛流行與傳播的關(guān)鍵。