■ 孫宇 肖調(diào)義（湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南長沙 410128）

大鯢性腺發(fā)育中激素水平及產(chǎn)卵效果分析

■ 孫宇 肖調(diào)義（湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南長沙 410128）

大鯢屬于由水生脊椎動物向陸生脊椎動物過渡的類群，其結(jié)構(gòu)比較原始、獨特，在研究動物進化過程和地理分布范圍等方面有著重大的科學價值，有“活化石”之稱，是國家二級保護野生動物。2002年以前，大鯢人工養(yǎng)殖的甚少，繁殖也很少。隨著研究的深入和技術(shù)的成熟，2002年以后繁殖技術(shù)漸漸成熟（章克家，2002；余東勤，2009）。目前人工大鯢養(yǎng)殖規(guī)模最大的是陜西漢中市，劉愛華在2007年報道全市大鯢存量約為10萬尾，2009年大鯢的養(yǎng)殖總量超過100萬尾，且繁殖產(chǎn)量占全國比例的70%（刑可利，2001），同年湖南省養(yǎng)殖企業(yè)已有35家左右，大鯢繁殖量在4萬～5萬（羅慶華，2009）。截至2012年底，貴州大鯢存池量為43.5萬尾左右，僅次于陜西；張家界市養(yǎng)殖估規(guī)模也超過40萬尾，至2014年，全國存量達到400萬尾，人工繁殖和馴養(yǎng)大鯢對于大鯢資源保護和有效利用極其有利。

當前，在大鯢的人工繁殖過程中繁殖率較低，人工繁殖工作中關(guān)鍵點即是對親本成熟情況的準確掌握； 對此，陽愛生等 （1981） 對大鯢性腺發(fā)育過程在組織學層面進行了觀察，楊焱清等 （2003） 選用彩色多普勒儀檢測雌性大鯢卵徑的大小用來檢驗其性腺發(fā)育整個過程，這些研究者的研究結(jié)果在一定程度上為探尋大鯢成熟情況提供了理論基礎，但也存在著局限性，如對親本會造成損傷、檢測準確度不夠等。睪酮 （TT） 和雌二醇 （E2）是動物體內(nèi)固有的2 種性激素，其功用是調(diào)節(jié)動物的生長發(fā)育和生殖行為，對確定動物成熟度非常關(guān)鍵（汪小東等，2000；鄧利等，2001；張利紅等，2001；何正侃等，2003）。本實驗通過檢測大鯢親本體內(nèi)睪酮和雌二醇含量的變化，旨在尋求大鯢成熟情況的有用檢測方式，為其規(guī)?；敝车旎碚摶A。

表1 E2檢測結(jié)果表

表2 T值檢測結(jié)果

1 材料與方法

實驗大鯢親本為湖南億年酉魚公司自繁自養(yǎng)的二代親本，鯢齡為 2004年人工繁殖挑選培育且經(jīng)過連續(xù) 3 年以上人工催產(chǎn)繁殖，人絨毛膜促性腺激素 （HCG） ELISA 試劑盒、人雌二醇 （E2） ELISA 試劑盒和人睪酮（T） ELISA 試劑盒等試劑盒均購買于上海銳聰實驗室設備有限公司，檢測儀器為北京 DNM-9602 型酶標分析儀。

2 樣品采集與測定

根據(jù)歷史繁殖資料抽取4組產(chǎn)卵產(chǎn)精效果好大鯢，4組產(chǎn)卵產(chǎn)精較差大鯢，和4組隨機抽取的大鯢，并于每月7～10日期間，于 8∶00 左右采集尿樣。操作時使親本大鯢的腹部朝上，然后用毛巾擦干或者吸干泄殖孔周圍的水漬，再用去掉針頭的10mL注射器插入泄殖孔內(nèi)1.0cm左右的深處，同時用手輕輕擠壓大鯢的腹部，收集尿液，采集后編號直接進入實驗室進行檢測，所有檢測均嚴格按照儀器操作規(guī)程和試劑說明書進行，同時此實驗鯢在2014年人工催產(chǎn)中按原有技術(shù)體系進行分類，并分不同時間點進行催產(chǎn)授精孵化，并對每一尾鯢所產(chǎn)卵與所授精卵進行獨立的記錄和分區(qū)存放。

本實驗采用酶聯(lián)免疫法（ELISA） 檢測大鯢尿液中雌二醇（E2） 和睪酮 （T） 這2種激素水平。酶聯(lián)免疫法的基本原理是讓抗體與酶復合物結(jié)合，然后通過顯色來定量檢測。具體來說即將 E2 和 T 單克隆抗體包被于固相表面，再在固相抗體中加入要檢測的尿液，尿液中 E2 和 T與之接觸后，迅速形成抗原抗體復合物并附著于固相載體上，然后再加用辣根過氧化物接的 E2 和 T 抗體，再次形成抗體一抗原一酶聯(lián)抗體復合物，即雙抗體夾心復合物。洗去過量沒有結(jié)合的酶聯(lián)抗體，最后加人酶的作用底物與顯色劑，觀察顏色變化。反應結(jié)果的顏色深淺與尿液HCG、E2 和 T濃度呈正比。

3 實驗結(jié)果

E2 的檢測結(jié)果及檢測圖如表1所示。數(shù)據(jù)顯示大鯢尿液中E2值的變化存在明顯的周期性，湖南中部地區(qū)在5月時均值為33.5pmol/L，6月提高到了47.7pmol/L，7月時達到59.5pmol/L，7月下旬到8月上旬時達到頂峰均值為83.3ng/mL，隨后即開始下降分別為69.6pmol/L，54.7pmol/L，50pmol/L，并以41pmol/L進入越冬期，且產(chǎn)后激素水平下降速度加快。通過 7月20日和 8 月 10 日兩次催產(chǎn)表明在 7 月底8 月初催產(chǎn)時效果最佳，催產(chǎn)率達到86%，且產(chǎn)卵量大，經(jīng)產(chǎn)順利，時間過早過遲產(chǎn)卵效果均比較差。

T值檢測結(jié)果及圖譜如表2所示。數(shù)據(jù)顯示大鯢尿液中T值的變化存在明顯的周期性，湖南中部地區(qū)在 5月時均值為 238.1pg/mL，6月均值為 281pg/ mL，7月時達到310.2pg/mL，8 月時達到頂峰360pg/mL，9月時開始明顯下降均值為214.5pg/mL，之后分別為190.3pg/mL，174pg/mL進入越冬中。通過7月20日和 8月10日兩次催產(chǎn)在湖南地區(qū)氣候天7月底8月初是最佳的催產(chǎn)時間，但如在7月時其激素水平未能達到290pg/mL時，其基本催產(chǎn)不產(chǎn)精，且在300pg/mL左右時精子質(zhì)量也略顯差。

4 討論

4.1 雌二醇（E2）和睪酮（T）含量與時間變化

本次研究結(jié)果顯示，大鯢尿液中雌二醇和睪酮含量呈現(xiàn)出周期性變化，表現(xiàn)為在生殖季節(jié)前逐漸達到高峰，繁殖期過后逐漸降低到正常值，基本呈現(xiàn)出拋物線變化，高峰在 7 月下旬到 8 月中旬，且結(jié)果表明雌性大鯢峰值略早于雄鯢，此結(jié)果與很多研究結(jié)論基本一致（陽愛生，1981；肖漢兵，1995；楊焱清，2003）。大鯢的雌二醇和睪酮含量達鼎盛時期后，不論是否進行人工催產(chǎn)或者是否產(chǎn)卵產(chǎn)精，雌二醇和睪酮含量均會降低；這就不難看出，大鯢性腺發(fā)育是一個從生長發(fā)育—成熟—退化—生長發(fā)育的一個相對固定、循環(huán)往復的生殖生理過程，達到性腺成熟的高峰是7 月中下旬。

4.2 雌二醇和睪酮含量與人工催產(chǎn)效果

當在7月時雌二醇含量大于55.8 pmol/L時，雌性個體在外來激素的作用下，均可產(chǎn)卵，且產(chǎn)卵效果都較好，低于此值則可能不產(chǎn)卵，或產(chǎn)出空膠帶，但雄鯢性成熟E2臨界點暫不能準確確定需下一步更準確的研究對比。值得指出的是，當E2含量＞90 pmol/L，若其含量繼續(xù)上升，選擇恰當?shù)臅r間催產(chǎn)不但會使催產(chǎn)效果好，并且受精率得到提高，若E2含量從最高點迅速減少，雖然能夠產(chǎn)出卵粒，但大多產(chǎn)卵不會順利，卵質(zhì)黃白相間，混濁，且受精率不高，甚至不能受精。雄性睪酮在7月時含量＞280pg/ mL時，在外來激素的作用下也均可產(chǎn)精，且精子活力與量均較好，但如含量在320pg/mL以上時建議最好安排7月催產(chǎn)不宜進入8月，否則其產(chǎn)精效果明顯差，且死亡體，殘體精子多。大鯢人工催產(chǎn)試驗還顯示，在19℃～21℃的水溫條件下，雄性大鯢催產(chǎn)效應期過后能采到成熟精子的時間為3～5d，此時受精成功的機會最高，無論提前或超時其基本不授精，因此為確保大鯢人工繁殖成功，夏季水溫應該盡量控制在 20℃以下為宜。

4.3 睪酮含量與副性征

副性征是生物體在繁殖期所表現(xiàn)出來的特有癥狀，雄性大鯢的副性征是生殖孔內(nèi)緣兩側(cè)有 2 排白色的小突起，成熟良好時，多數(shù)在生殖孔周圍出現(xiàn)“桔瓣狀”的光滑肌肉隆起圈，并伴有白點變紅或肛門四周皮膚泛紅等情況。本研究結(jié)果表明，凡具有雄性副性征的個體均能檢測到T值；不管雌鯢還是雄鯢，副性征越明顯，檢測出的TT 值越高。

5 結(jié)論

當大鯢尿液中雌二醇（E2）值在90pmol/L時所產(chǎn)卵質(zhì)量最好，授精與產(chǎn)苗最高，雄鯢睪酮（T）值在280pg/ mL時精子活力最好授精與產(chǎn)苗最高。（參考文獻略）