朱俊訪　李　博

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中藥研究

響應(yīng)面法優(yōu)化淡竹葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝

朱俊訪李博

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣州,510520)

目的:探討響應(yīng)面法優(yōu)化淡竹葉總黃酮大孔樹脂純化工藝。方法:比較四種大孔樹脂對(duì)淡竹葉總黃酮的吸附和解吸性質(zhì),篩選合適的樹脂,采用響應(yīng)面法優(yōu)化純化工藝。結(jié)果:通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,較佳純化工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度0.12 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,洗脫液用量6BV。結(jié)論:通過響應(yīng)面法優(yōu)選的淡竹葉總黃酮大孔樹脂純化工藝穩(wěn)定可行,預(yù)測(cè)性好。

淡竹葉;總黃酮;大孔樹脂;響應(yīng)面法

中藥淡竹葉為禾本科植物淡竹葉(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥莖葉,性寒,味甘、淡,歸心、胃、小腸經(jīng),有清熱除煩,利尿的功效,用于熱病煩渴,小便赤澀淋痛,口舌生瘡等癥[1-4]。淡竹葉主要含有黃酮、三萜類、多糖、酚性成分、氨基酸、有機(jī)酸及多種微量元素,其中黃酮為主要有效成分[5-8]。本實(shí)驗(yàn)以淡竹葉總黃酮為對(duì)象采用大孔樹脂進(jìn)行純化,通過響應(yīng)面法對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化,為淡竹葉總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　資料

1.1儀器 電子天平:AUY120,島津;分光光度計(jì): UV2600,尤尼科儀器有限公司

1.2受試藥物 淡竹葉(市售),干燥后粉碎過60目篩備用;大孔樹脂:D101、AB-8、S-8(天津光復(fù)精細(xì)化工)DA-201;鄭州勤實(shí)科技有限公司;試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以蘆丁為對(duì)照品,在510 nm下采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法測(cè)定黃酮含量。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品逐級(jí)稀釋,精密吸取上述稀釋液2 mL,置50 mL量瓶,并以80%乙醇補(bǔ)充至12.0 mL,加入5%NaNO2溶液1.5 mL,混勻,放置6min后加入10%Al(NO3)3溶液1.5 mL,混勻,6min后再加入4%NaOH溶液20 mL,混勻,用水定容。得到濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/ mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL的蘆丁溶液,以陰性對(duì)照為空白,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,得到回歸方程y=11.023x+0.0295,R2=0.999 2[9]。

2.2上柱液制備 取淡竹葉50 g,粉碎過50目篩,石油醚脫脂,80℃水浴下以500 mL 80%乙醇回流提取2h,將提取液濃縮離心,加水定容至250 mL,調(diào)節(jié)pH值為6.0,得竹葉黃酮供試液(相當(dāng)于0.2 g生藥/mL)。

2.3大孔樹脂預(yù)處理 大孔樹脂用95%乙醇浸泡24h,再用95%乙醇沖洗,至流出液加蒸餾水無白色混濁、無異味,繼續(xù)用蒸餾水洗至無醇味,備用。

3　結(jié)果

3.1樹脂靜態(tài)吸附考察 準(zhǔn)確稱取已處理的4種(AB-8、S-8、D101、D201)大孔樹脂20 g,分別置于250 mL具塞三角瓶中,分別精密吸取10 mL供試液,加水稀釋至100 mL,振蕩吸附24h,濾過,濾液吸取2 mL按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定。濾渣水洗,抽濾,用濾紙吸干,準(zhǔn)確加入80%乙醇100 mL,振蕩解吸24h,濾過,濾液吸取2 mL按3.1項(xiàng)下方法測(cè)定,其余濾液置水浴揮干,恒重[10-11]。結(jié)果見表1,可以看出D101型樹脂對(duì)淡竹葉黃酮具有較佳的吸附和洗脫效果。

表1　4種樹脂對(duì)總黃酮的影響

3.2動(dòng)態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

3.2.1上樣液質(zhì)量濃度的影響 取處理好的D101大孔樹脂20 g,取0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL的樣品溶液,按2 BV/h的體積流量通過樹脂柱,測(cè)定不同上樣體積條件下流出液黃酮含量,直到吸附飽和出現(xiàn)泄漏點(diǎn),繪制泄露曲線。見圖1。質(zhì)量濃度為0.2 g/mL和0.4 g/mL的上樣液均在2 BV(40 mL)達(dá)到泄漏點(diǎn),0.6 g/mL的上樣液在1.5BV(30 mL)達(dá)到泄漏點(diǎn),且質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的上樣液吸附率最高,因此初步?jīng)Q定上樣體積為2 BV。

圖1　上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響

3.2.2洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 取處理好的D101大孔樹脂20 g,吸附2 BV 0.2 g/mL的樣品溶液,用2BV蒸餾水洗脫,再分別用35%、50%、65%、80%、95%的乙醇,以2 BV/h的流速洗脫,繪制吸附曲線。見圖2。當(dāng)洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)大于65%,洗脫率增加比較緩慢,因此初步?jīng)Q定較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

3.2.3洗脫液乙醇用量的影響 取處理好的D101大孔樹脂20 g,吸附2BV 0.2 g/mL的樣品溶液,用2BV蒸餾水洗脫,再分別用1、2、4、6、8、10 BV體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,以2 BV/h的流速洗脫,繪制吸附曲線。見圖3。當(dāng)洗脫液用量超過2BV(40 mL)體積后,再增加用量洗脫率增加緩慢,因此初步確定較優(yōu)洗脫液用量為4BV(80 mL)。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹脂吸附效果的影響

圖3　乙醇用量對(duì)樹脂吸附效果的影響

3.3效應(yīng)面優(yōu)化D101大孔樹脂純化工藝

3.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取處理好的D101大孔樹脂20 g,考察上樣液質(zhì)量濃度(A)、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)及洗脫液用量(C)對(duì)黃酮洗脫率和純度的影響,采用DesignExpert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法安排試驗(yàn),以獲取最適工藝參數(shù)。采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平見表2,試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)洗脫率和黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的值,再求幾何平均值得“總評(píng)歸一值(OD)”,以O(shè)D值為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)純化工藝進(jìn)行優(yōu)化[12-16]。

表2　因數(shù)水平設(shè)計(jì)表

表3　響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.3.2模型擬合及方差分析 以O(shè)D值對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合,各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行方差分析,得多元線性回歸方程Y=0.5175-0.2585A+ 5.625×10-3B+0.1531C(R2=0.517 4,P=0.020 3),雖然P值通過檢驗(yàn),但相關(guān)系數(shù)過小,模型擬合度不高,預(yù)測(cè)性較差。二項(xiàng)式擬合模型為Y=0.7450-0.2585A+5.6257×10-3B+0.1532C-0.0786AB+ 0.0743AC-0.1504BC-0.1634A2-0.2142B2-0.1058C2(R2=0.894 9,P=0.010 4),方程顯著并相關(guān)系數(shù)較高,可作為分析及預(yù)測(cè)的模型。

圖4　上樣液質(zhì)量濃度與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)OD值的交互影響

3.3.3最佳工藝條件預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 根據(jù)回歸方程,做響應(yīng)面圖(圖4～6),分析上樣液質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和洗脫液用量對(duì)總黃酮提前的影響。根據(jù)擬合方程結(jié)果顯示,淡竹葉總黃酮大孔樹脂純化的最佳工藝條件為:上樣液質(zhì)量濃度0.12 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,洗脫液用量5.96 BV。按最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)測(cè)計(jì)算的OD值平均值為0.893 2,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.31%。OD值的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差較小,表明建立模型可靠,具有良好的預(yù)測(cè)性。

4　討論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化淡竹葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝,通過靜態(tài)吸附試驗(yàn)篩選出D101型樹脂,最終確定較優(yōu)的純化條件為上樣液質(zhì)量濃度0.12 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,洗脫液用量6BV。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出上樣液濃度、洗脫液的濃度和用量對(duì)黃酮純化有不同程度的影響,其中洗脫液的用量影響最顯著,各因素間存在不同程度的交互作用。效應(yīng)面的優(yōu)化結(jié)果與試驗(yàn)值差異小,對(duì)大孔樹脂純化淡竹葉總黃酮的純度,具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

圖5　上樣液質(zhì)量濃度和洗脫液用量對(duì)OD的交互作用

圖6　乙醇體積分?jǐn)?shù)和洗脫液用量對(duì)OD值的交互影響參考文獻(xiàn)

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(2015-10-15收稿 責(zé)任編輯:張文婷)

Optimization of Purification Technology Using Macroporous Resin for Total Flavonoids from Lophatherum Gracile with Response Surface Method

Zhu Junfang,Li Bo
(Guangdong Food anddrug Vocation College,Guangzhou 510520,China)

Objective:To optimize purification technology using macroporous resin for total flavonoids from lophatherum gracile with response surface method.Methods:Compare the adsorption anddesorption properties of four macroporous resin on total flavonoids of lophatherum gracile.Select the appropriate resin to optimize purification process with response surface method.Results:According to the analysis of experimentaldata,it was better to optimize purification process with the mass concentration 0. 12 g/mL of sample solution,volume fraction 75%of ethanol and eluentdosage 6BV.Conclusion:It was stable and feasible with good predictability to optimize the macroporous resin purification process for total flavonoids from lophatherum gracile with response surface method.

Lophatherum gracile;Total flavonoids;Macroporous resin;Response surface method

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.04.039

朱俊訪(1981.06—),男,碩士,實(shí)驗(yàn)師,研究方向:天然產(chǎn)物有效成分分離與分析,E-mail:junfang-zhu@163.com

李博(1982.07—),女,碩士,實(shí)驗(yàn)師,研究方向:中藥有效成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),E-mail:lib@gdyzy.edu.cn