劉曉潭，田林強，王宏偉，郭志豪

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院骨二科，河南新鄉(xiāng) 453003)

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過表達miR-29a對人椎間盤退變髓核細胞凋亡的影響

劉曉潭，田林強，王宏偉，郭志豪

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院骨二科，河南新鄉(xiāng) 453003)

目的探討miR-29a在人椎間盤退變髓核(NP)細胞凋亡的調(diào)控作用。方法體外培養(yǎng)椎間盤退變NP細胞，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒cherry/miR-29a，脂質(zhì)體Lipofectamine轉(zhuǎn)染進入NP細胞，應用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(RT-qPCR)檢測NP細胞中miR-29a 的表達變化，Western blot 法檢測凋亡相關蛋白Caspase-3 前體的表達變化，流式細胞儀檢測NP細胞凋亡水平變化。結(jié)果NP細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒cherry/miR-29a 48 h 后，NP細胞中miR-29a 的表達水平較NP細胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NP細胞中的miR-29a明顯升高(P<0.05)；凋亡相關蛋白Caspase-3前體的水平則明顯下降(P<0.05)；NP細胞凋亡水平明顯升高 (P<0.05)。結(jié)論在椎間盤NP細胞中過表達miR-29a 能促進NP細胞凋亡，其機制可能是通過Caspase-3途徑起作用。

椎間盤；細胞凋亡；Caspase-3；過表達；miR-29a；椎間盤退變NP細胞

據(jù)相關報道，約80%的老年人患腰痛疾病[1]。其中椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是椎間盤源性腰痛等一系列下腰痛疾病的主要病因，引起負責基質(zhì)合成的髓核(nucleus pulposus,NP)細胞凋亡，導致髓核細胞數(shù)量減少，是這個病變過程的關鍵原因[2-4]。所以，通過抑制髓核細胞的凋亡，可能會促進髓核基質(zhì)的合成，達到延緩椎間盤退變的目的，具有重要的生物學和醫(yī)學意義。

微小RNA(miRNA) 是一類長度約22 bp的內(nèi)源性非編碼RNA，為生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控因子[5]，在生物體細胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[6]。目前已有研究報道微小RNA-29a(miR-29a) 參與肝癌細胞凋亡的調(diào)控[7]，但miR-29a調(diào)控椎間盤退變髓核細胞凋亡及其相應的靶基因鮮有報道，本研究通過脂質(zhì)體lipofectamine轉(zhuǎn)染法使miR-29a成功在體外培養(yǎng)的椎間盤退變NP細胞中過表達，觀察miR-29a對凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)前體表達水平的影響，并通過流式細胞儀檢測NP細胞的凋亡水平，檢測過表達miR-29a對椎間盤退變髓核細胞凋亡的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料NP細胞來源于新鄉(xiāng)醫(yī)學院附屬醫(yī)院的椎間盤退變患者。其中，男6例(50%)，女6例(50%)，患者均簽署知情同意書且在未接受治療前收集樣本，包括NP細胞。

1.2方法

1.2.1試劑及儀器定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP (日本Takara公司)；總蛋白提取試劑盒(BestBio公司)；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、TRIzol(美國Invitrogen公司)；Guava凋亡檢測試劑盒( 南京凱基生物公司)，Caspase-3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的抗體(santa cruz公司)，反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(RT-qPCR)反應儀為ABIPRISM@7500(ABI 公司)。

1.2.2miR-29a真核表達載體的構(gòu)建由miRBase網(wǎng)站查詢獲得miR-29a前體序列(M10000087)，應用primer 5.0設計引物，上游引物序列F：5′-GCG AAT TCA TGG TTA AAG AGC CCA ATG TAT GCT G-3′，下游引物序列R：5′-CGG GTA ACC AGT ATA ACC ATT CAT GAT ATG CTA A-3′，劃線處分別為EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位點，引物由上海life公司合成。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物及pmR-mcherry質(zhì)粒3 h，T4連接酶16 ℃過夜連接酶切回收產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH 5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)Amp抗性篩選和挑選陽性克隆提取重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定后測序驗證。

1.2.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將NP細胞株于37 ℃，5% CO2及一定濕度下培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清中至6孔板中的細胞生長密度達70%～80%，用lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒分別將重組質(zhì)粒cherry/miR-29a和空載體cherry轉(zhuǎn)染至NP細胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。每孔質(zhì)粒量為0.5 ug，終濃度為150 nmol/L。試驗分為3個組：重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和空白組。

1.2.4RT-qPCR檢測miR-29a在椎間盤組織及NP細胞中的表達情況采用RT-qPCR來檢測miR-29a轉(zhuǎn)錄水平的差異。Trizol法提取組織或細胞的總RNA，oligo dT法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行miR-29a mRNA水平定量PCR檢測。microRNA莖環(huán)引物為：上游5′-ACA CTC CAG CTG GGT TTG GGA GTC T-3′，下游5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3′；U6基因為內(nèi)參：上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。RT-qPCR擴增程序為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min (1 個循環(huán))；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40 個循環(huán)。RT-qPCR反應完成后進行熔解曲線分析，為單一峰，目的基因為特異性擴增。為確保qRT-PCR結(jié)果的準確性，對每一個樣品重復分析3次，包括靶標基因(miR-29a)和看家基因(U6)。觀察IDD患者椎間盤組織與健康對照組織中miR-29a的表達情況。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測NP細胞的凋亡水平用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化NP細胞；4 ℃、500 r/min離心10 min，棄上清液，收集NP細胞;將NP細胞懸于標記緩沖液中;加入Guava試劑，避光室溫反應15 min;加入標記緩沖液，用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot蛋白水平檢測細胞凋亡蛋白Caspase-3前體的表達轉(zhuǎn)染48 h后收集樣品，細胞去培養(yǎng)基后加入RIPA裂解液，蛋白質(zhì)定量試劑盒 (BCA 法)蛋白定量后按一定濃度進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)恒壓電泳，濃縮膠80 V，20～30 min，分離膠100 V 電泳，電泳時間根據(jù)Marker的位置確定；恒流276 mA 轉(zhuǎn)膜2.5 h；室溫封閉1 h；1∶1 000稀釋Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；1∶4 000稀釋Ⅱ抗室溫孵育1 h；暗室曝光。

2　結(jié)　　果

2.1患者椎間盤組織中miR-29a的表達情況miR-29a在IDD患者椎間盤組織中的水平顯著高于健康對照組織中的水平(P<0.05)，見圖1。

2.2重組質(zhì)粒cherry/miR-29a的構(gòu)建與鑒定PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,可見到與預期片段大小相符的條帶(圖2A)。對重組質(zhì)粒cherry/miR-29a進行EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切檢測,獲得約4 500 bp和400 bp的條帶 (圖2B)，與預期大小相符，miR-29a前體片段已成功連接至cherry空質(zhì)粒中；對重組質(zhì)粒進行測序,結(jié)果也證明插入的片段是miR-29a序列。

圖1　椎間盤退變患者與健康對照組織中

1、2：miR-29a前體片段PCR產(chǎn)物；3：miR-29a前體片段PCR產(chǎn)物；4：cherry/miR-29a雙酶切產(chǎn)物；M1：DL 500 bp Marker。

圖2PCR產(chǎn)物及EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切產(chǎn)物電泳圖

2.3RT-qPCR檢測miR-29a的表達水平cherry/miR-29a感染NP細胞24 h后，RT-qPCR檢測結(jié)果是miR-29a的表達水平較cherry空載體的表達顯著升高(P<0.01),見圖3。

圖3　　miR-29a的相對表達量

2.4過表達miR-29a對NP細胞凋亡的影響NP細胞轉(zhuǎn)染cherry/miR-29a后，采用Guava流式細胞方法檢測，空白組[(3.12±0.46)%]和空質(zhì)粒組[(3.33±0.79)%]與重組質(zhì)粒組細胞的凋亡率[(18.32±1.77)%]比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

A:空白組；B：空質(zhì)粒組；C：重組質(zhì)粒組。

圖4流式細胞術(shù)檢測NP細胞的凋亡情況

2.5miR-29a對NP細胞相關凋亡蛋白Caspase-3的影響空白組與空質(zhì)粒組中Caspase-3前體的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；重組質(zhì)粒組中Caspase-3前體的表達量均低于于空質(zhì)粒組和空白組(P<0.05)。如圖5所示，過表達miR-29a后，Caspase-3的蛋白水平的表達出現(xiàn)明顯的下調(diào)。與空白組(1.12±0.09)和空質(zhì)粒組(1.09±0.11)相比較，重組質(zhì)粒組細胞(0.50±0.15)中凋亡相關蛋白Caspase-3水平低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1：空白組；2：空質(zhì)粒組；3：重組質(zhì)粒組。

圖5Western blot檢測Caspase-3前體的水平

3　討　　論

人類miR-29 家族存在不同的亞型，分別由miR-29a/29b/29c組成。近年來，多項研究證實miR-29與細胞增殖及凋亡有著重要的作用。如在間變淋巴瘤激酶(ALK)陽性間變性大細胞淋巴瘤中，miR-29a的表達下調(diào)，從而引起MCL-1過表,促進細胞凋亡；在神經(jīng)細胞成熟的過程中，miR-29b直接靶向BH3基因，抑制細胞凋亡[8-9]。而有報道顯示miR-29a參與椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展，在本試驗結(jié)果證實miR-29a在椎間盤退變患者椎間盤組織中的表達水平與健康正常組織相比差異有統(tǒng)計學意義。

有報道使用病毒載體感染法使心肌細胞過表達 pre-miRNA (miRNA 的前體)，結(jié)果顯示細胞內(nèi)pre-miRNA的表達量升高超過1 000倍，而miRNA 成熟體卻只有1.5～2.0 倍的提升[10]。本試驗中所采用的特異性轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 進一步地提高了細胞的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染miR-29a的重組質(zhì)粒cherry/miR-29a 進入體外培養(yǎng)的原代NP細胞，經(jīng)RT-qPCR驗證，NP細胞中miR-29a 成熟體的表達量較空白組和空質(zhì)粒組明顯上升，成功在NP細胞內(nèi)過表達miR-29a。

綜上所述，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，miR-29a 的過表達能促進椎間盤NP細胞的凋亡，進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3前體的表達水平也下降，提示NP細胞的凋亡可能是通過降解Caspase-3實現(xiàn)的。本研究為證實miRNA參與椎間盤NP細胞凋亡調(diào)控，闡明椎間盤退變的分子機制和有效治療椎間盤退變提供了有利的試驗依據(jù)。

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Overexpression of MicroRNA-29a regulates nucleus pulposus cells apoptosis in human intervertebral disc degeneration

LiuXiaotan,TianLinqiang,WangHongwei,GuoZhihao

(SecondDepartmentofOrthopaedics,theThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo investigate the role of MicroRNA-29a (miR-29a) on nucleus pulposus cells apoptosis in human intervertebral disc degeneration.MethodsIntervertebral disc degeneration nucleus pulposus cells was isolated，cells were transfected with recombinant plasmid cherry/miR-29a by lipofectamine method,and then RT-qPCR was used to measure the expressive level of miR-29;the protein expressive level of Caspase-3 was detected by Western blot and flow cytometry(FCM) was applied to detect the cells apoptosis.ResultsNP cells transfer to the recombinant plasmid cherry/miR-29a.The miR-29a expression level of NP cell was significantly higher compared with the blank and empty plasmid group(P<0.05);the apoptosis-related protein Caspase-3 precursor level significantly decreased (P<0.05) while the NP cell apoptosis level significantly increased (P<0.05) after 48 hours.ConclusionThe overexpression of miR-29a might regulate nucleus pulposus cells apoptosis of human intervertebral disc degeneration,and the mechanisms among it might be concerned with Caspase-3 pathway．

intervertebral disk；apoptosis；Caspase-3；overexpression；miR-29a；intervertebral disc degeneration nucleus pulposus cells

劉曉潭(1976-)，講師，碩士，主要從事骨關節(jié)疾病及脊柱研究。

論著·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.007

R34

A

1671-8348(2016)14-1893-03

2015-11-18

2016-01-06)