鄧仕任，蔡明宸，夏林波，王　鑫，朱夏敏

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧　大連　116600)

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火麻仁薄層色譜鑒別用對照提取物的研制與應(yīng)用*

鄧仕任，蔡明宸，夏林波，王鑫，朱夏敏

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600)

研制被薄層色譜鑒別用火麻仁對照提取物，以替代對照藥材用于火麻仁的薄層鑒別。從制備工藝考察、提取物穩(wěn)定性影響因素考察以及提取物性狀等方面制訂薄層色譜鑒別用火麻仁對照提取物的制備和保存方法，并比較對照藥材與對照提取物在薄層鑒別中的應(yīng)用結(jié)果。結(jié)果表明：制備方法為：火麻仁藥材粉末(過二號篩)加25倍乙醚脫脂后，藥渣加10倍甲醇加熱回流提取1 h，濾過，減壓蒸去甲醇，所得浸膏用10倍甲醇復(fù)溶，加入與浸膏等重量的柱層析硅膠(200～300目)，混勻，減壓蒸干甲醇，過九號篩即得。該對照提取物與火麻仁藥材的薄層鑒別效果一致。本研究制備的火麻仁薄層鑒別用對照提取物穩(wěn)定可靠，可以替代火麻仁對照藥材用于火麻仁及其成方制劑的質(zhì)量控制分析。

火麻仁；薄層色譜鑒別；對照提取物；質(zhì)量控制

對照提取物是2005版《中國藥典》首次增加的一類新的中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，2010版《中國藥典》已增加至16個品種的藥材對照提取物和揮發(fā)油對照提取物[1]。以對照提取物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對于控制中藥的質(zhì)量具有如下優(yōu)點[2-3]：(1)與化學(xué)對照品比較，分離難度小容易獲得，且價格低廉，相當(dāng)于同時采用多個化學(xué)對照品進(jìn)行鑒別，提高了鑒別的專屬性；(2)與對照藥材相比較，它具有良好的均勻性與穩(wěn)定性，能直接溶于有機(jī)溶劑配制成供檢測用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，與對照藥材提取過程繁瑣耗時相比，它簡便快捷，提高了藥檢部門的檢測效率。在2010版《中國藥典》中，對照提取物在中藥的質(zhì)量控制方面主要用于成方制劑，而在藥材與飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中使用較少，目前僅有巴戟天、肉豆蔻、川芎等[4-6]少數(shù)藥材被報道制備成薄層色譜用對照提取物。目前，火麻仁藥材薄層鑒別用參照物仍為火麻仁對照藥材，但由于火麻仁中含有大量的脂肪油，在貯藏過程中易發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)變化，產(chǎn)生游離脂肪酸、過氧化物和低分子醛、酮類等分解產(chǎn)物，影響對照藥材的穩(wěn)定性和質(zhì)量[7-8]；此外，薄層鑒別時，尚需要將火麻仁對照藥材經(jīng)過回流脫脂、過濾、回流提取等流程，方能得到對照藥材儲備液，過程繁瑣，因而亟需開發(fā)一種更穩(wěn)定、更方便的火麻仁薄層鑒別用對照物質(zhì)。本研究在2015年版中國藥典科研立項的資助下，依照國家藥典委員會《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)要求》的相關(guān)規(guī)定，制備了一種火麻仁薄層用對照提取物，并考察了該對照提取物替代對照藥材的可行性。

1　儀器與試藥

AY220電子分析天平，日本島津；DZF-6021真空干燥箱，蘇州江東精密儀器有限公司；PQX-330A-12H智能人工氣候箱，寧波萊?？萍加邢薰荆籆HRIST真空冷凍干燥機(jī)，德國產(chǎn)；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DZF-6021真空干燥箱，蘇州江東精密儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FW-100高速萬能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UVmini-1240型紫外可見分光光度計，日本島津；數(shù)顯HH-4恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；KQ2200型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為娃哈哈純凈水。

三批次火麻仁藥材分別產(chǎn)自河北、廣西、貴州。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室翟延君教授鑒定均為?？浦参锎舐镃annabissativaL.的干燥成熟果實。火麻仁對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院(批號為121097-201104)。

2　方法與結(jié)果

2.1制備方法考察

以藥典記載的火麻仁對照藥材的提取方法(取本品粉末 2 g，加乙醚50 mL，加熱回流1 h，濾過，藥渣再加乙醚20 mL洗滌，棄去乙醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液)為基礎(chǔ)，重點考察火麻仁經(jīng)乙醚脫脂后，甲醇回流提取過程中的相關(guān)工藝。

2.1.1粉碎粒度的考察

對粉碎粒度進(jìn)行單因素考察，以提取物的過篩率和浸膏得率做為指標(biāo)，結(jié)果如表1所示。

表1　粉碎粒度和過篩率考察

由表1可知，藥材的粉碎粒度越細(xì)，浸膏得率越高；但我們同時還發(fā)現(xiàn)，隨著篩板目數(shù)的增加，藥材的過篩率急劇下降。其主要原因在于，火麻仁藥材的含油量特別高(可達(dá)30%)，如果長時間過度粉碎，則油脂會大量析出，形成稠膏狀固體，難以過篩；因此粉碎時間和強(qiáng)度都不宜過高，故而藥材粒度較大，只能在20目篩時有較高的過篩率。

此外，在過40目篩時，我們還發(fā)現(xiàn)，沒有過篩的基本都是火麻仁的果皮和種皮部分，而種仁部分則可全部過篩。因此如果采用40目篩，則會人為改變藥材的原始組成和成分。

綜上，我們最終將粉碎粒度定為20目。

2.1.2提取溶劑種類的考察

考察不同溶劑對浸膏得率的影響，由表2結(jié)果可知，甲醇提取率較高，故選用甲醇。

表2　提取溶劑考察

2.1.3提取條件的優(yōu)化

分別考察料液比、提取次數(shù)和提取時間對浸膏得率的影響，結(jié)果見表3?？梢娺x擇料液比(藥材:甲醇，V:V)為 1:10時，提取1次，每次1 h時，提取率較高，且經(jīng)濟(jì)合理。

表3　提取條件的考察

2.1.4硅膠加入量的考察

脫脂后的火麻仁藥材經(jīng)甲醇提取，所得浸膏呈粘稠狀膠質(zhì)物。經(jīng)真空干燥不能得到固體粉末，經(jīng)冷凍干燥雖能成粉末，但極易吸濕，暴露在空氣中，1 min內(nèi)即由粉末團(tuán)聚成黏膠狀物質(zhì)，無法保存。所得膠狀浸膏經(jīng)甲醇/乙醇反復(fù)醇沉數(shù)次，可得到膠質(zhì)較少的粉末狀提取物，但得率太低(低于0.2%)，無制備意義。

基于上述情況，我們最終選擇了以硅膠吸附拌樣的方式制備提取物粉末。我們選用了常見的柱層析硅膠(200～300目)，考察了提取物浸膏與硅膠用量比，結(jié)果見表4。可見，當(dāng)硅膠用量太少(2:1)時，吸附不完全，提取物不能成粉末狀，仍未粘稠膠狀物；硅膠用量太大(1:2)，死吸附在硅膠上的物質(zhì)太多，造成提取物溶出率降低。綜合上述結(jié)果，我們認(rèn)為提取物浸膏與硅膠用量比為1:1是比較合適的，此時提取物能完全吸附于硅膠顆粒上，且加甲醇溶解時，溶出率也較高。

表4　硅膠加入量考察

*溶出率=可溶解在甲醇中的提取物質(zhì)量/吸附于硅膠上的提取物質(zhì)量。

2.2最終制備方法

取火麻仁藥材粉末(過二號篩)200 g，加乙醚5000 mL，加熱回流1 h，濾過，藥渣再加乙醚2000 mL洗滌，棄去乙醚液，藥渣加甲醇2000 mL，加熱回流1 h，濾過，減壓蒸干甲醇，得浸膏，稱重，應(yīng)為9～10 g。浸膏用100 mL甲醇復(fù)溶，加入與浸膏等重量的柱層析硅膠(200～300目)，混勻，減壓蒸干甲醇，過九號篩，即得。

所得提取物為黃綠色至綠色粉末，氣微香，具吸濕性，得率應(yīng)為7%～9%。

2.3對照提取物替代對照藥材的可行性驗證

取火麻仁對照提取物粉末0.2 g，加甲醇1 mL，超聲處理2 min，離心，上清液作為供試品溶液。另取火麻仁對照藥材2 g，加乙醚50 mL，加熱回流1 h，濾過，藥渣再加乙醚20 mL洗滌，棄去乙醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15:1:0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛乙醇溶液-硫酸(1:1)混合溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果見圖1?？梢?，對照提取物與對照藥材在TLC色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，證明所制備的火麻仁對照提取物替代火麻仁對照藥材是完全可行的。

圖1　火麻仁對照藥材及3批不同產(chǎn)地火麻仁藥材制成的對照提取物的TLC圖

2.4火麻仁對照提取物的穩(wěn)定性測試

按照國家藥典委員會制訂的“國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)要求”的相關(guān)規(guī)定，以性狀、溶解性、TLC圖譜穩(wěn)定性等為指標(biāo)，考察火麻仁對照提取物在高溫、高濕和強(qiáng)光照射下的穩(wěn)定性，為藥品的生產(chǎn)、包裝、貯存、運輸條件提供科學(xué)依據(jù)。

2.4.1高溫度試驗

供試品開口置適宜的潔凈容器中，60 ℃溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進(jìn)行檢測。若60 ℃無明顯變化，則不再進(jìn)行40 ℃試驗。

結(jié)果表明，在60 ℃溫度下，對照提取物經(jīng)10天放置后溶出率無明顯變化，此外，提取物性狀和TLC行為也與高溫試驗前無明顯變化。

2.4.2高濕度試驗

供試品開口置恒濕密閉容器中，在25 ℃于相對濕度90%±5%條下放置10天，要求吸濕增重不得超過5%，否則應(yīng)考察相對濕度75%±5%下的穩(wěn)定性。

結(jié)果在相對濕度90%條件下，樣品吸濕高達(dá)30%～40%，不符合要求，因此我們將再樣品置于相對濕度75%±5%條件下考察穩(wěn)定性。樣品在25 ℃于相對濕度75%±5%條下放置10天，于第5天和第10天分別取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目要求檢測，同時準(zhǔn)確稱量試驗前后供試品的重量，以考察供試品的吸濕潮解性能。結(jié)果表明，提取物性狀與高濕度試驗前有所變化，雖粉末顏色無明顯變化，但稍有結(jié)塊現(xiàn)象，且在高濕度環(huán)境下(相對濕度75%±5%)，粉末吸濕較明顯(第10天吸濕增重可達(dá)11%～16%)。此外，提取物溶出率和TLC行為均與高濕試驗前無明顯變化。

2.4.3強(qiáng)光照射試驗

供試品開口放在裝有日光燈的光照箱或其他適宜的光照裝置內(nèi)，于照度為4500 lx±500 lx的條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進(jìn)行檢測，特別要注意供試品的外觀變化。

結(jié)果表明，提取物性狀、溶出率及TLC行為均與強(qiáng)光照射試驗前無明顯變化。

3　結(jié)　論

(1) 本制備方法提供一種火麻仁對照提取物的制備方法，與常規(guī)提取物一般為經(jīng)溶劑提取制成的干燥浸膏的傳統(tǒng)方法不同，由于火麻仁對照提取物直接干燥后得到的浸膏吸濕現(xiàn)象非常嚴(yán)重，暴露在空氣中約1 min即會吸濕成液態(tài)，不符合對照提取物研制要求中的穩(wěn)定性要求，無制備意義。由此本制備方法首次采用了硅膠拌樣的方法，通過考察了提取物浸膏與硅膠用量比，我們認(rèn)為提取物浸膏與硅膠用量比為1:1是比較合適的。硅膠拌樣法使火麻仁對照提取物均勻吸附于硅膠上，降低了火麻仁對照提取物的吸濕性，大大增強(qiáng)了其均勻性和穩(wěn)定性，最終得到了符合《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)要求》的粉末狀對照提取物。

(2)穩(wěn)定性影響因素實驗結(jié)果表明，3批火麻仁對照提取物供試品在高溫和強(qiáng)光條件下比較穩(wěn)定均未見變色、黏連、結(jié)塊和吸潮現(xiàn)象，而在高濕度條件下吸濕比較嚴(yán)重，因此建議，本品應(yīng)密閉，置干燥處保存。

(3)火麻仁對照提取物具有配制方便、性質(zhì)穩(wěn)定、均勻性良好、便于稱量、貯存等特點，薄層色譜結(jié)果表明，此對照提取物可代替火麻仁對照藥材作為處方中含有火麻仁的中藥薄層鑒別用對照物質(zhì)。

(4) 對照提取物雖然具有很多使用方便等優(yōu)點，但是也有其自身缺點，如品種少，無明確的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，怎么保證對照提取物的均一性和穩(wěn)定性等問題亟待解決。供薄層鑒別使用的對照提取物藥材來源需要進(jìn)行質(zhì)控，以保證評價的客觀性。在標(biāo)定和保證穩(wěn)定性方面，可引入指紋圖譜技術(shù)對其標(biāo)定，指紋圖譜技術(shù)可客觀地反映對照提取物的質(zhì)量全貌，可確保不同批次對照提取物質(zhì)量穩(wěn)定均一，也可在以后研究過程中深入有效部位、飲片、以及復(fù)方制劑三方面對照提取物的研究，以補(bǔ)充中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，提高質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：370．

[2]張潮林，徐文杰，沈雪梅．《中國藥典》2005年版中藥對照品的應(yīng)用[J]．齊魯藥事，2007，26 (1)：29-33．

[3]陸兔林，翟為民，蔡寶昌，等．對照提取物在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J]．中國中藥雜志，2013，38(3)：462-465．

[4]林錦鋒，楊志業(yè)，李曼莎，等．巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取物的研制與應(yīng)用[J]．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2015(27)：22-25．

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[6]呂維．川芎薄層鑒別用對照提取物的研究[D]．成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2014．

[7]朱江， 蔡明宸，王鑫，等．非水反相色譜法測定火麻仁中甘油三酯含量[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2015(13)：53-55．

[8]鄧仕任，夏林波，郭瑩．響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取火麻仁油[J]．食品工業(yè)科技，2012(5)：243-245．

Study on the Preparation and Application of Cannabis Fructus TLC Reference Extract

DENGShi-ren,CAIMin-chen,XIALin-bo,WANGXin,ZHUXia-min

(College of Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning Dalian 116600, China)

Cannabis fructus TLC reference extract was prepared and its application in the quality control of Cannabis fructus and preparations as a reference drug was explored. Cannabis fructus TLC reference extract was prepared by opting processing route and investigating stability influencing factors. The application to TLC identification items of Cannabis fructus was performed according to the Chinese Pharmacopoeia 2010 edition. Results showed that Cannabis fructus TLC reference extract can play the same role as Cannabis fructus reference drug with the same quantity and quality. Cannabis fructus TLC reference extract for TLC identification can be used for quality control analysis of Cannabis fructus and preparations. The research provided a foundation for further development of TCM reference extracts.

Cannabis fructus; TLC identification; reference extract; quality control

2015年版中國藥典一部科研立項(火麻仁藥材及飲片)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃(LJQ2015070)；全國中藥飲片炮制規(guī)范(第二批)研究任務(wù)(2015-YP-24)。

鄧仕任(1979-)，男，博士，副教授。

夏林波(1977-)，女，博士，副教授。研究方向為中藥中藥分析。

R284.1

A

1001-9677(2016)05-0071-03